基于斑馬魚毛細胞損傷模型的抗耳毒活性組分的研究.pdf

1、聽力功能障礙是由于各種原因引起雙耳不同程度損傷而達不到正常功能水平的感覺功能障礙。若其不能被及時發(fā)現(xiàn)并進行良好的干預將嚴重影響患者的言語、認知及情感的發(fā)育，進而影響其身心健康和生活質量，同時也會加重社會經(jīng)濟負擔。
　　氨基糖苷類抗生素是用于靶向革蘭陰性菌的一類重要的抗感染劑，作為一類廣譜抗菌且無明顯過敏性的抗生素在臨床一直備受青睞，但其應用卻因巨大的耳毒性和腎毒性而受到很大限制。即便如此，在治療多耐藥性菌群感染時，慶大霉素等氨基糖

2、苷類抗生素發(fā)揮著極其重要的作用。由于其價廉易得、抗菌譜廣等特點，臨床應用也相對廣泛，引發(fā)的聽力障礙在治療人群占有較高的比例。同時，臨床上尚無療效良好的治療耳聾藥物。因此，建立一種藥源性耳聾模型，進一步尋找抗耳聾藥物達到克服其毒性而不影響其藥效的方法，并進一步闡明耳聾機制和藥物抗耳聾機制顯得尤為重要。以往比較常見的藥物耳毒性評級機制是建立在藥物對豚鼠或者大鼠的內(nèi)耳毛細胞損傷基礎之上的。由于這兩種模式動物在對藥物的毒性安全進行考察時會存在較

3、大局限性，斑馬魚作為新型模式動物也逐漸吸引了越來越多的科研工作者。
　　許多傳統(tǒng)中藥及相關方劑被證明對耳聾具有一定的療效，而對具體到某一種中藥的抗耳聾活性組分卻是知之甚少。此外，藥用植物內(nèi)生真菌素以代謝產(chǎn)物豐富、活性多樣化而成為近年天然藥物研究的熱點之一，但其用于抗耳毒性活性成分篩選的研究甚少。因此，本研究以慶大霉素為模型藥物，旨在建立一種穩(wěn)定的藥源性斑馬魚毛細胞損傷模型，通過對多種中藥材粗提物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三相萃取物

4、和水相，以及從兩株華南毛蕨內(nèi)生真菌CYC6和CYC18發(fā)酵液中分離純化的部分次級代謝產(chǎn)物進行篩選，快速尋找具有抗耳毒活性組分。主要研究內(nèi)容包括：
　?。?）利用已知具有明確耳毒性的慶大霉素建立藥源性斑馬魚毛細胞損傷模型，并將一側斑馬魚神經(jīng)丘（SO1、SO2、O1、OC1）毛細胞形態(tài)及其數(shù)量的變化作為檢測指標。將斑馬魚分別置于100、50、25及10μmol/L慶大霉素溶液中孵育8、6和4 h發(fā)現(xiàn)，10μmol/L慶大霉素中孵育6

5、h可以使毛細胞損傷程度達到一半，建立達到類似IC50效果的毛細胞損傷模型。同時通過不同濃度（0.5％、0.2%）DMSO作用不同時間（6、4及2h）發(fā)現(xiàn)，DMSO對斑馬魚具有一定的損傷作用；0.2%DMSO對斑馬魚毛細胞損傷很小，可作為合適的藥物助溶劑。
　?。?）利用所建立的模型，首次將具有抗耳毒性的N-乙酰半胱氨酸（NAC）和依達拉奉單獨作為陽性藥物，揭示出該藥源性斑馬魚毛細胞損傷模型的穩(wěn)定性，以及后期用于大規(guī)模篩選時的可行性

6、。研究發(fā)現(xiàn)，200μmol/L NAC對慶大霉素介導的斑馬魚毛細胞損傷具有拮抗作用；250μmol/L依達拉奉也對其具有保護作用。
　　（3）多種中藥提取物中抗耳毒活性組分的篩選。利用已建立的斑馬魚毛細胞損傷模型研究不同濃度（20、100和500μg/mL）香附、蟬蛻、地龍、苦杏仁、郁金、薄荷、紅花、菊花、黃芩、黃芪、梔子及白芍這12味中藥萃取物（石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相），篩選出了具有抗耳毒性的活性組分，包括香附乙酸