醫(yī)用臭氧對(duì)斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的影響.pdf

1、背景：
　　新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是指圍生期各種因素，主要是指窒息，引起的新生兒腦能量代謝及功能障礙，重者出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，如抽搐、昏迷等，甚至在嬰兒期死亡，幸存者可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，HIE是兒童致殘的重要原因。盡管目前圍生醫(yī)學(xué)在不斷的進(jìn)步，圍產(chǎn)期窒息患兒發(fā)生率在逐漸減少，但HIE仍是一種威脅嬰幼兒健康的嚴(yán)重疾病，目前尚無特效治療。在國外亞低溫治療已經(jīng)成為新生兒腦損傷的常規(guī)治療，方法有選擇性頭部降溫或全身降溫。但Tag

2、inMA等進(jìn)行Meta分析時(shí)，總結(jié)多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明亞低溫治療對(duì)新生兒中度腦病作用顯著，對(duì)新生兒重度腦病作用不明顯。亞低溫雖然在國外廣泛用于臨床，但在國內(nèi)還未全面推廣，作為臨床醫(yī)師要認(rèn)清其禁忌癥及并發(fā)癥，選擇亞低溫治療時(shí)要確保再灌注損傷階段的各種生理病理反應(yīng)已減輕。當(dāng)患兒存在嚴(yán)重感染，凝血功能障礙或多器官功能衰竭時(shí)要慎重選擇該治療方案。同時(shí)要注意治療時(shí)間窗的選擇，一般在出生后6小時(shí)內(nèi)，如果延遲至發(fā)病后8.5小時(shí)，亞低溫治療則沒有神經(jīng)保護(hù)作

3、用。在國內(nèi)被認(rèn)為能夠有效改善HIE患兒預(yù)后的治療方法是高壓氧(HBO)治療，它能改善患兒的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，降低病死率和幸存患兒后遺癥發(fā)生率。國內(nèi)大量的臨床研究肯定了HBO對(duì)新生兒HIE的近期療效較好，但缺乏多中心隨機(jī)研究，關(guān)于HBO的遠(yuǎn)期療效報(bào)道少。然而，國外醫(yī)學(xué)并不十分支持HBO在臨床的應(yīng)用，他們認(rèn)為HBO在治療局部缺血性腦卒中時(shí)能改善神經(jīng)行為和梗死面積，但應(yīng)用到臨床上尚需要更多的臨床前研究證明HBO的有效性及作用機(jī)制。其它治療方法如氧

4、自由基抑制劑和清除劑，興奮性氨基酸拮抗劑、神經(jīng)保護(hù)劑、干細(xì)胞移植、基因治療等尚需更多的動(dòng)物研究和臨床驗(yàn)證。
　　臭氧用于消毒和治療疾病有150年的歷史了。1840年德國化學(xué)家C.ESchonbein電解水的時(shí)候發(fā)現(xiàn)一種特殊臭味的氣體，將它命名為臭氧。在一戰(zhàn)期間，德國士兵將臭氧用于治療厭氧菌感染所致的氣性壞疽，發(fā)現(xiàn)臭氧能控制感染，有抗炎的特性。1857年，兩位德國物理學(xué)家發(fā)明第一臺(tái)醫(yī)用臭氧發(fā)生機(jī)，臭氧治療開始用于臨床。1929年美國

5、出版了一本名為《臭氧及其醫(yī)療作用》的書，書中描述了臭氧能治療114種疾病。上個(gè)世紀(jì)50年代，由于缺乏基礎(chǔ)和臨床研究及臭氧本身存在的危害，臭氧的治療效果受到各界的質(zhì)疑。后來隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷進(jìn)展，積累了大量研究結(jié)果，其作用機(jī)制及效果逐漸被闡明，醫(yī)用臭氧逐漸被醫(yī)學(xué)工作者認(rèn)可。1999年，意大利發(fā)起并建立了國際臭氧醫(yī)療協(xié)會(huì)(IMOS)，旨在促進(jìn)醫(yī)用臭氧在臨床的研究與應(yīng)用，制定臭氧治療規(guī)范。目前臭氧主要用于治療腰椎間盤突出、關(guān)節(jié)痛、肩周炎、糖尿

6、病潰瘍等疾病。臭氧在細(xì)胞有氧代謝及抗氧化防御系統(tǒng)方面起積極的作用，是治療能量衰竭有關(guān)疾病的基礎(chǔ)。臭氧能減少血膽固醇，刺激抗氧化應(yīng)答，在靜止肌修飾氧合作用，改善神經(jīng)功能，是缺氧和缺血綜合征的補(bǔ)充治療。
　　動(dòng)物，如大鼠、小鼠、兔、猴，對(duì)人類生物的研究有巨大的貢獻(xiàn)。除了人們熟悉的鼠、兔等動(dòng)物外，斑馬魚作為一種逐漸興起的脊椎模式動(dòng)物，憑借其節(jié)約成本、繁殖能力強(qiáng)、體積小、發(fā)育迅速、胚胎透明能夠輕易連續(xù)觀察發(fā)育階段以及其基因與人類基因高度相

7、似等特點(diǎn)已成為生物學(xué)家的新選擇。斑馬魚基因表達(dá)是保守的，與人類有69％的同源性，47％的人類基因與斑馬魚同源基因一一對(duì)應(yīng)。通過檢測3176個(gè)人類致病基因，發(fā)現(xiàn)其中有82％在斑馬魚至少有一個(gè)同源基因。這也就意味著在斑馬魚身上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適于人體，所以斑馬魚模型可以用于人類疾病的研究。斑馬魚可以模擬多種人類疾病，已有研究者利用斑馬魚胚胎和成魚制作缺氧缺血性腦損傷模型，研究其發(fā)病機(jī)制及治療方法。
　　目的：

8、>　　基于以上的研究背景，本實(shí)驗(yàn)旨在利用便捷、高效的斑馬魚模型構(gòu)建斑馬魚幼魚缺氧再灌注損傷模型，模擬新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBD)，探討應(yīng)用醫(yī)用臭氧對(duì)新生兒腦損傷的作用機(jī)制及影響。本研究通過觀察對(duì)腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)(超氧化物歧化酶(SOD)活性、（丙二醛）MDA、總抗氧化水平）及SODmRNA表達(dá)水平的影響，結(jié)合斑馬魚幼魚行為及病理學(xué)改變，探討醫(yī)用臭氧對(duì)缺氧性腦損傷的斑馬魚幼魚是否具有保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，為新生兒缺氧缺血性腦損傷開拓

9、治療思路，并探索不同濃度對(duì)干預(yù)效果的影響，為進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平的研究資料，以期為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.動(dòng)物模型的分組與建立
　　同一批次野生型斑馬魚卵受精后5天(dpf)，缺氧實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)分為正常對(duì)照組、H/R組（hypoxia/reoxygen，系統(tǒng)水復(fù)氧）、處理組（缺氧-醫(yī)用臭氧復(fù)氧組），其中處理組根據(jù)臭氧濃度不同分為:0.05ppm、0.1 ppm、0.2ppm三個(gè)亞組。均勻向

10、密閉水箱中充入高純氮?dú)猓苎鮾x監(jiān)測氧濃度，當(dāng)水中溶解氧低于0.5mg/L時(shí)，將H/R組和各處理組幼魚放入缺氧裝置中，建立斑馬魚幼魚缺氧腦損傷模型。到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，即幼魚沉底靜止不動(dòng)達(dá)1min，身體彎曲或抽搐，將幼魚撈出，分別放入系統(tǒng)水和醫(yī)用臭氧中進(jìn)行復(fù)蘇，以缺氧/復(fù)氧后3h為觀察時(shí)間點(diǎn)。正常對(duì)照組水中溶解氧濃度在7.5mg/L左右。
　　2.各項(xiàng)指標(biāo)的檢測方法
　　2.1 幼魚的一般狀況
　　復(fù)蘇期間計(jì)時(shí)各組幼魚蘇醒時(shí)間

11、，顯微鏡下觀察缺氧/復(fù)氧后3h幼魚心率變化、運(yùn)動(dòng)能力、生存分析等指標(biāo)，初步評(píng)估缺氧/復(fù)氧對(duì)幼魚生存狀態(tài)的影響及醫(yī)用臭氧對(duì)幼魚的影響。
　　2.2 腦組織病理變化
　　顯微鏡下觀察TUNEL染色腦組織細(xì)胞凋亡變化。
　　2.3 腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)
　　測定各組斑馬魚幼魚缺氧/復(fù)氧后3h腦組織SOD、MDA、總抗氧化水平氧化應(yīng)激指標(biāo)。
　　2.4 腦組織SODmRNA表達(dá)水平
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PC

12、R(qRT-PCR)分析幼魚缺氧/復(fù)氧后3h腦組織SODmRNA表達(dá)水平。
　　3.統(tǒng)計(jì)方法
　　對(duì)檢測所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，正態(tài)分布計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，結(jié)果用spss20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析;兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，其中方差齊者用LSD法，方差不齊者用Dunnett's法進(jìn)行分析。Kaplan-Meier法用于估計(jì)生存函數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)

13、用Graphpad Prism5.0作圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的圖片處理。
　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)物一般狀況
　　正常組斑馬魚幼魚一般狀況良好，心率平穩(wěn)，運(yùn)動(dòng)能力正常。缺氧/復(fù)氧后3hH/R組幼魚運(yùn)動(dòng)能力減弱，游程縮短，出現(xiàn)抽搐、靜止不動(dòng)等表現(xiàn)。缺氧/復(fù)氧后3h內(nèi)各組幼魚（H/R組、0.05ppm-臭氧組、0.1 ppm臭氧組、0.2-ppm臭氧組）平均蘇醒時(shí)間分別為:37.5±6.1 min、33.0±3.8min、32.5±

14、5.0min、32.6±5.6min，其中H/R組幼魚平均蘇醒時(shí)間最長，差異有顯著性。與正常對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)相比，0.1ppm復(fù)氧組幼魚心率和H/R幼魚平均心率稍慢，但差異無明顯差異，0.05ppm復(fù)氧組和0.2ppm復(fù)氧組幼魚心率加快，但差異無顯著性。缺氧后14天內(nèi)，正常對(duì)照組、H/R及各處理組(0.05ppm、0.1 ppm、0.2ppm)幼魚中位生存時(shí)間分別為12.87天，7.67天，9.96天，10.35天，8.96天;總體生存

15、率差異有顯著性(P＜0.001)。
　　2.各組斑馬魚幼魚腦組織TUNEL染色
　　H/R和處理組幼魚腦組織TUNEL染色陽性細(xì)胞的核呈斑點(diǎn)狀棕褐色深染，形態(tài)不規(guī)則，大小不一，呈顆粒狀分布于核周或濃縮成團(tuán)，另有少數(shù)細(xì)胞核呈均勻黃色淡然，TUNEL染色陽性細(xì)胞散在分布于正常細(xì)胞之間，越靠近中心區(qū)域越明顯。0.05ppm臭氧水復(fù)氧組和0.2ppm臭氧水復(fù)氧組細(xì)胞凋亡指數(shù)與H/R無明顯差異，0.1 ppm臭氧水復(fù)氧組凋亡細(xì)胞指數(shù)明

16、顯低于H/R，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.各組斑馬魚幼魚腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)
　　3.1 各組幼魚腦組織總抗氧化水平變化
　　與正常對(duì)照組相比，H/R組3h總抗氧化能力下降，差異無顯著性(P＞0.05)，而處理組總抗氧化能力升高(P＜0.05)，其中0.1 ppm組上升最明顯。
　　3.2 各組幼魚腦組織SOD水平變化
　　與正常對(duì)照組相比，H/R組3h SOD活力降低(P＜0.05)，處

17、理組SOD活力增加(P＜0.05)，其中0.1 ppm組上升最明顯。
　　3.3 各組幼魚腦組織MDA水平變化
　　與正常對(duì)照組相比，H/R組MDA含量在3h時(shí)升高(P＜0.05)，處理組MDA含量也升高，但與H/R組無顯著差異(P＞0.05)。
　　4.各組幼魚腦組織SODmRNA表達(dá)水平變化
　　與正常對(duì)照組相比，H/R組在3h時(shí)SOD表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，各處理組在3h時(shí)SOD表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05