新型合成水蛭肽Hirulog-s的體內(nèi)外溶栓作用研究.pdf

1、血液中凝血和抗凝血、纖溶和抗纖溶系統(tǒng)保持動態(tài)平衡，共同維持血液的流動性，一旦平衡失調(diào)，可導致血管內(nèi)凝血，形成血栓栓塞性疾病，或引起出血性疾病。目前國內(nèi)外臨床使用的治療血栓栓塞性疾病藥物主要包括抗凝血藥物、抗血小板藥和纖維蛋白溶解藥。在這些藥物中肽類（小于100個氨基酸）抗凝血藥物，如水蛭素、比伐盧定以及可口服的小分子類肽藥物（如希美加群）等，具有起效快、副作用較低等突出優(yōu)點，是今后抗凝溶栓藥的重點發(fā)展方向。新型的抗凝溶栓藥物不僅可以從抗

2、凝血酶途徑發(fā)揮溶栓作用，而且對纖溶酶途徑也有促進作用。本文研究了新型合成水蛭肽Hirulog-s在體外的纖溶酶促動力學和體內(nèi)的溶栓效果，以及對纖維蛋白活性的影響，進而評價了Hirulog-s對纖溶系統(tǒng)的藥理作用。
　　第一章綜述了凝血酶抑制劑在血栓栓塞性疾病中的作用機理和臨床用藥特點。凝血酶抑制劑按以凝血酶為靶點，用凝血酶抑制劑來抑制血栓的生成是臨床治療血栓的方法之一。凝血酶抑制劑按作用機制可分為間接凝血酶抑制劑和直接凝血酶抑制劑

3、。間接凝血酶抑制劑如肝素、華法林等在治療血栓形成過程有其應用價值，但存在一定局限性。而臨床直接凝血酶抑制劑有優(yōu)于肝素等抗凝藥物的功效，同時也存在一定缺點，所以人們開始研究新的抗凝溶栓藥物。近年來，運用先進的生物工程技術(shù)已成功開發(fā)了多種直接凝血酶抑制劑已被用于臨床，治療效果優(yōu)于傳統(tǒng)抗凝藥物。而新型的凝血酶抑制劑還需要更加深度地研究其作用機理和臨床效果。
　　第二章構(gòu)筑單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑（pro-uPA）和纖溶酶原（plg）相

4、互活化反應的體外纖溶體系，添加Hirulog-s成反應體系不同濃度，比較pro-uPA和plg相互活化反應體系中纖溶酶（plm）作用于pro-uPA反應的酶促反應動力學常數(shù)（Km，kcat），分析Hirulog-s對plm作用于pro-uPA反應的催化速率及親和性。纖溶活性作用檢測采用底物酶促反應法，酶促反應動力學常數(shù)的測定基于單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑激活纖溶酶原的反應。在plm作用于pro-uPA的反應體系中，30μmol·L-1

5、Hirulog-s與對照相比kcat值增大了3.1倍，Km值減小了1.6倍，表明Hirulog-s可以顯著提高plm的最大催化速率同時增強親和性。30μmol·L-1 Hirulog-s與對照相比kcat/Km值增大了4.75倍，表明Hirulog-s明顯提高了plm的催化效率。通過活性對比表明Hirulog-s的纖溶活性強于水蛭肽比伐盧定（Hirulog-1）。
　　第三章研究新型合成水蛭肽Hirulog-s體內(nèi)溶血栓藥效作用。

6、基于體外纖溶實驗來進一步評價Hirulog-s的體內(nèi)溶血栓作用。通過建立FITC-肺血栓大鼠模型，以生理鹽水組作為對照組，pro-uPA組作為陽性對照組，Hirulog-s分高、中、低不同劑量組進行處理，以及與Hirulog-1高、中、低不同劑量組進行對比，給藥12h后檢測血漿熒光值變化情況并進行肺切片組織形態(tài)學觀察，評價Hirulog-s高、中、低不同劑量的溶栓效果。結(jié)果表明在急性大鼠肺血栓栓塞模型中，注射1.6mg/kg·bw的Hi

7、rulog-s后的肺組織切片圖顯示肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁均勻，殘存著肺血栓溶解后的痕跡效果最好，與陽性對照pro-uPA類似。而Hirulog-1的溶栓效果通過肺組織切片觀察不明顯，效果不如Hirulog-s。通過檢測大鼠血漿中熒光強度值發(fā)現(xiàn)1.6 mg/kg·bw的Hirulog-s在肺血栓大鼠血漿中熒光強度值相比對照組表現(xiàn)極顯著差異，其在體內(nèi)的纖維蛋白溶解作用與pro-uPA相當。
　　第四章研究新型合成水蛭肽Hirulog-s

8、對大鼠纖維蛋白活性的影響。研究對象Wistar大鼠通過尾靜脈注射高、中、低不同濃度的Hirulog-s，同樣以pro-uPA作為陽性對照，采用加鈣法檢測血液優(yōu)球蛋白溶解時間，ELISA試劑盒檢測血液中纖維蛋白原和纖維蛋白原降解產(chǎn)物的含量。數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計后表明處理120min后優(yōu)球蛋白溶解時間被縮短了32s-40s，Hirulog-s處理組與生理鹽水對照組之間具有顯著差別（P＜0.05），表明Hirulog-s提高了大鼠血漿中的纖溶活性。在