新型高效抗微生物肽的優(yōu)化設(shè)計(jì)與合成及其體內(nèi)外抗多重耐藥菌的研究.pdf

1、目的：
　　各種耐藥致病菌在全世界范圍內(nèi)的播散，使耐藥致病菌感染所致疾病成為全人類共同的災(zāi)難。目前世界范圍內(nèi)細(xì)菌耐藥的發(fā)展呈現(xiàn)出向多藥耐藥發(fā)展的趨勢，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的細(xì)菌，以及多藥耐藥結(jié)核桿菌正在蔓延。更為嚴(yán)峻的是能夠抵抗所有抗生素的全耐藥細(xì)菌(panresistantbacteria）已經(jīng)出現(xiàn)，一旦人類感染這類細(xì)菌，可能會(huì)面臨無藥可治的境地。面對(duì)耐藥細(xì)菌迅速蔓延、感染性疾病

2、致死率持續(xù)攀高的嚴(yán)峻形勢，控制耐藥細(xì)菌感染造成的危害已經(jīng)成為各國政府高度關(guān)注的焦點(diǎn)，尋找和研制有效控制耐藥細(xì)菌感染的新策略和新藥物，已經(jīng)成為當(dāng)今世界各國科學(xué)家當(dāng)務(wù)之急的研究目標(biāo)。
　　經(jīng)典抗生素研發(fā)的主要策略之一是從已有各種類別抗生素中研發(fā)新的衍生物。伴隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，越來越多的細(xì)菌對(duì)現(xiàn)有抗生素產(chǎn)生交叉耐藥，采用結(jié)構(gòu)修飾和改造研發(fā)新型抗生素受到限制，找到新型抗生素的機(jī)會(huì)越來越少，抗生素研發(fā)速度明顯減慢。而且這些新型抗生素應(yīng)用

3、于臨床后，并未避免耐藥性的產(chǎn)生，細(xì)菌很快對(duì)這些抗生素產(chǎn)生了新的耐藥性。當(dāng)前抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)速度已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了研發(fā)新抗生素的速度。為了有效對(duì)抗日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥，必須尋找新的突破口。
　　抗微生物肽不僅具有廣譜的殺菌活性，而且在招募巨噬細(xì)胞和增強(qiáng)先天免疫系統(tǒng)作用中發(fā)揮中樞角色。最值得關(guān)注的是，抗微生物肽主要通過物理滲透作用于細(xì)菌胞膜而產(chǎn)生殺菌活性，由于微生物很難改變其自身磷脂雙分子層的胞膜結(jié)構(gòu)，不易對(duì)抗微生物肽產(chǎn)生耐藥性，因此抗

4、微生物肽已經(jīng)成為抗耐藥菌研究中最具希望的新一代候選藥物。
　　抗微生物肽的研究中也存在著一些問題，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：第一，大多數(shù)抗微生物肽毒性高，對(duì)靶細(xì)胞的選擇性低，易使紅細(xì)胞膜破裂溶血。第二，大多數(shù)抗微生物肽不穩(wěn)定，易被蛋白酶水解，體內(nèi)半衰期短；許多在體外有明顯抗菌活性的抗微生物肽，在生理鹽濃度和血漿條件下活性喪失。第三，大多數(shù)抗微生物肽由20個(gè)以上氨基酸組成，生產(chǎn)成本高。
　　針對(duì)上述問題，我們采取兩種設(shè)計(jì)思路，即

5、設(shè)計(jì)全新結(jié)構(gòu)抗微生物肽和修飾改造已知結(jié)構(gòu)抗微生物肽。利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)上述兩類抗微生物肽，并采用固相合成的方法加以合成。以當(dāng)前臨床感染中最常見、耐藥發(fā)生率和耐藥強(qiáng)度最高的七株致病菌為研究目標(biāo)，觀察所合成的抗微生物肽在體內(nèi)、體外的抗菌活性，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入的探討，旨在從中篩選出高效、低毒、穩(wěn)定、不易產(chǎn)生耐藥性的新型抗微生物肽。
　　方法：
　　1.計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)新型抗微生物肽：依據(jù)已知抗菌肽的理化性質(zhì)和構(gòu)效關(guān)系理論，采用

6、全新設(shè)計(jì)和改造設(shè)計(jì)兩種途徑，分別設(shè)計(jì)出全新的N-末端連接不同長度脂肪酸鏈的抗微生物肽FA1、FA2、FA3、FA4、FA5、FA6；應(yīng)用Accelrys/InsightII分子模型軟件進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助分析，根據(jù)昆蟲來源抗菌肽thanatin的γ-核心模序結(jié)構(gòu)，改造設(shè)計(jì)出抗微生物肽US1、US2、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10和DS1、DS2、DS3、DS4、DS6、DS7、DS8、DS9、DS10。對(duì)上述

7、兩類抗微生物肽的羧基末端進(jìn)行酰胺化修飾，得到一系列C-末端酰胺化的多肽序列。
　　2.新型抗微生物肽的合成、純化與鑒定：以HOBt/DIC為縮合劑，在Rink樹脂上，采用Fmoc保護(hù)α氨基酸，從C-端(羧基端)向N-端(氨基端)固相合成C-末端酰胺化的多肽鏈。先用MALDI-TOF質(zhì)譜儀測定多肽粗品的分子量；再用RP-HPLC色譜儀對(duì)多肽粗品進(jìn)行分離純化；最后用ESI質(zhì)譜儀測定多肽純品的分子量。對(duì)于環(huán)化的多肽鏈，采用空氣氧化的方法

8、形成分子內(nèi)二硫鍵。多肽氧化過程中，用反向高效液相色譜法（RP-HPLC）不斷分析多肽氧化色譜峰與還原色譜峰面積的變化；監(jiān)測多肽氧化的進(jìn)程并對(duì)氧化后的多肽進(jìn)行RP-HPLC純化；最后用ESI質(zhì)譜儀測定氧化前后多肽純品的分子量。
　　3.抗微生物肽體內(nèi)外抗多重耐藥菌藥效學(xué)的研究：測定ESBLs-EC和MRSE的平板克隆形成單位(CFU)與光密度值(OD600)之間的關(guān)系；測定所設(shè)計(jì)的25條抗微生物肽對(duì)七株多重耐藥菌的最小抑菌濃度(MI

9、C)和最小殺菌濃度(MBC)；通過測定ESBLs-EC和MRSE不同時(shí)間點(diǎn)的生長曲線，觀察抗微生物肽DS1、US1和DS7對(duì)其生長的影響；通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)ESBLs-EC和MRSE的菌落數(shù)(CFU)，觀察抗微生物肽DS1、US1和DS7對(duì)其生長的抑制作用。通過溶血實(shí)驗(yàn)評(píng)估FA4、DS1、US1和DS7的溶血毒性；通過穩(wěn)定性試驗(yàn)評(píng)估DS1和DS7在50％血漿中穩(wěn)定性；通過耐藥性試驗(yàn)分別評(píng)估ESBLs-EC對(duì)DS1和MRSE對(duì)DS

10、7的耐藥性。構(gòu)建BALB/c小鼠的ESBLs-EC敗血癥模型和ICR小鼠的MRSE敗血癥模型，觀察DS1對(duì)BALB/c小鼠和DS7對(duì)ICR小鼠生存時(shí)間、存活率的影響；通過測定BALB/c小鼠臟器內(nèi)的CFU，觀察DS1對(duì)BALB/c小鼠臟器內(nèi)ESBLs-EC生長的抑制作用；通過BALB/c小鼠肺組織和脾組織的HE染色，觀察DS1對(duì)BALB/c小鼠肺臟和脾臟的保護(hù)作用。
　　4．抗微生物肽作用機(jī)制的研究：將DS1與ESBLs-EC，D

11、S7與MRSE共同孵育不同時(shí)間(30、60、90min)后，利用掃描電鏡觀察DS1對(duì)ESBLs-EC、DS7對(duì)MRSE表面形貌的影響。將6倍MIC濃度的DS1與ESBLs-EC，DS7與MRSE共孵育90min后，利用透射電鏡觀察ESBLs-EC和MRSE菌體內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的變化。用不同濃度(4、12、24μg/ml)的DS1與ESBLs-EC，DS7與MRSE孵育90min后，利用熒光顯微鏡觀察菌體內(nèi)熒光的強(qiáng)度及其分布。
　　結(jié)果：

12、
　　1．計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)新型抗微生物肽：設(shè)計(jì)了6條N-末端連接不同長度脂肪酸的全新肽鏈，計(jì)算機(jī)輔助改造含γ-核心模序遺傳標(biāo)志的thanatin，設(shè)計(jì)了10條未形成二硫鍵的含γ-核心模序的多肽序列和9條形成二硫鍵的含γ-核心模序的多肽序列。
　　2．抗微生物肽的合成、純化與鑒定：MALDI-TOF質(zhì)譜分析結(jié)果顯示所合成抗微生物肽粗品的分子量的測定值與理論值相符；所有抗微生物多肽粗品經(jīng)RP-HPLC純化后，其純度均達(dá)到95％以上

13、；ESI-MS鑒定結(jié)果顯示，多肽純品分子量的測定值與理論值相符。在形成分子內(nèi)二硫鍵的過程中，RP-HPLC分析顯示，隨著氧化時(shí)間的延長，多肽的氧化色譜峰面積逐漸變大，還原色譜峰面積逐漸變??；經(jīng)RP-HPLC純化后，所有環(huán)化多肽純度均達(dá)到95％以上；ESI-MS鑒定結(jié)果顯示，含有γ-核心模序的多肽鏈氧化前后的分子量相差2，與理論預(yù)測值相符。
　　3．抗微生物肽體內(nèi)外抗多重耐藥菌藥效學(xué)的研究：從19條含γ-核心模序的多肽中篩選獲得3條

14、具有抗菌活性抗菌肽，其中US1和DS1對(duì)陰性菌有明顯的抗菌活性，且作用效果(MIC)相同；DS7對(duì)陽性菌有較好的抗菌活性，其中對(duì)MRSE作用最強(qiáng)。從6條含脂肪酸的多肽中篩選出4條肽鏈具有抗菌活性，其中含C16軟酯酸的FA4活性最好。FA4、US1和DS1對(duì)9種菌的MBC均為2倍MIC，DS7對(duì)9種菌的MBC為≥2倍MIC。在2％和10％血漿中，F(xiàn)A4、DS1、US1和DS7在128μg/ml時(shí)均不引起溶血，它們的HC50遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陽性對(duì)照

15、蜂毒素（melittin）。血漿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：DS1和US1在血漿中代謝為活性更強(qiáng)的物質(zhì)，DS7在血漿中十分穩(wěn)定，而陽性對(duì)照藥S4(1-16)在血漿中降解顯著。ESBLs-EC和MRSE極易對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性，不易對(duì)DS1和DS7產(chǎn)生耐藥性。DS1能夠明顯延長BALB/c小鼠的生存時(shí)間(p<0.01)，提高小鼠的生存率(p<0.01)；能夠明顯抑制BALB/c小鼠臟器內(nèi)細(xì)菌的生長(p<0.01)；減輕ESBLs-EC對(duì)BALB/c

16、小鼠肺臟和脾臟的損害。DS7能夠延長ICR小鼠的生存時(shí)間(p<0.01)，提高ICR小鼠的生存率(p<0.01)。
　　4．抗微生物肽作用機(jī)制的研究：掃描電鏡下觀察到，隨著DS1和DS7作用時(shí)間的延長，ESBLs-EC和MRSE的水腫逐漸加劇，最終菌體破裂成不規(guī)則的小塊。透射電鏡下觀察到，DS1作用后，ESBLs-EC細(xì)胞壁破壞嚴(yán)重，染色質(zhì)絲及其它內(nèi)容物漏出，細(xì)菌僅殘留一個(gè)空殼。DS7作用后，MRSE出現(xiàn)異常的不均等分裂；菌體表面

17、出芽現(xiàn)象增多；菌體內(nèi)空泡增多、變大；細(xì)菌壁有破裂；菌體內(nèi)出現(xiàn)帶有環(huán)形螺紋的致密體。以PI（碘化丙啶）和SYTO9分別作為紅色和綠色熒光指示劑，顯微鏡下觀察到，隨著DS1藥物濃度的增加，反映細(xì)菌膜破損的紅色熒光逐漸增多，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；反映細(xì)菌膜完整的綠色熒光逐漸減少，熒光強(qiáng)度逐漸減弱；紅色和綠色熒光都分別呈現(xiàn)出大聚集和小聚集現(xiàn)象。隨著DS7藥物濃度的增加，反映細(xì)菌膜破損程度的紅色熒光的強(qiáng)度增加不明顯。
　　結(jié)論：
　　1．

18、通過全新和改造兩種途徑，設(shè)計(jì)并合成了一系列新型抗微生物肽，為抗微生物肽的設(shè)計(jì)和研究提供了新思路。
　　2．通過體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，篩選出抗微生物肽FA4、US1和DS7具有高效、低毒、穩(wěn)定和不易產(chǎn)生耐藥的優(yōu)點(diǎn)，首次證實(shí)γ-核心模序中的二硫鍵不是抗菌肽發(fā)揮活性的必要條件。
　　3．通過體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，證明DS1和DS7能夠分別延長敗血癥模型BALB/c小鼠和ICR小鼠的生存時(shí)間、并分別提高其生存率；DS1能有效抑制敗血癥模型BAL