長(zhǎng)-短鏈TSLP在屋塵螨誘導(dǎo)的哮喘氣道上皮屏障破壞中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　哮喘是一種常見(jiàn)的氣道慢性非特異性炎癥性疾病，近年來(lái)由于人們生活環(huán)境的改變，在全球范圍內(nèi)哮喘的發(fā)病率和病死率明顯增加，在全世界已影響了近3億人。氣道上皮細(xì)胞是機(jī)體和環(huán)境之間的第一道防線，它的主要功能是作為物理屏障抵御外部環(huán)境中微生物，氣體和過(guò)敏原等的侵襲。而氣道上皮細(xì)胞的物理屏障功能是依賴(lài)于細(xì)胞的完整性和細(xì)胞間連接蛋白的相互作用。我們的課題組前期研究已證明屋塵螨可以破壞氣道上皮屏障功能，而如何改善過(guò)敏原所致的氣

2、道上皮的損傷已經(jīng)成為哮喘防治研究的關(guān)注重點(diǎn)。
　　研究表明胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)在哮喘的預(yù)防和治療中扮演重要的角色。新近研究發(fā)現(xiàn)TSLP有不同的兩個(gè)亞型即長(zhǎng)鏈TSLP(lfTSLP)及短鏈TSLP(sfTSLP)，近年來(lái)有關(guān)sfTSLP和lfTSLP的不同作用已引起了關(guān)注，然而，sfTSLP和lfTSLP在哮喘中是否也發(fā)揮著不同的作用，現(xiàn)在尚未見(jiàn)到報(bào)道。
　　針對(duì)上述問(wèn)題，本課題擬在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討:
　

3、　1.lfTSLP是否促進(jìn)了HDM誘導(dǎo)的氣道上皮屏障破壞？
　　2.合成的sfTSLP是否可以保護(hù)HDM誘導(dǎo)的氣道上皮屏障破壞？
　　3.進(jìn)一步明確在HDM所導(dǎo)致的哮喘性氣道上皮屏障破壞中，lfTSLP發(fā)揮破壞作用和sfTSLP發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　研究方法
　　1.體外實(shí)驗(yàn):
　　1.1.人正常支氣管上皮細(xì)胞系(16HBE)的培養(yǎng)。
　　1.2.使用Western blot、RT-PCR、T

4、ER、FITC和免疫熒光檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)及不同濃度的HDM對(duì)16HBE細(xì)胞的影響。
　　1.3.使用RT-PCR、TER、FITC和免疫熒光檢測(cè)1α，25-Dihydroxyvitamin D3(1，25D3)對(duì)細(xì)胞sfTSLP表達(dá)及HDM導(dǎo)致的氣道上皮細(xì)胞屏障的破壞的影響。
　　1.4.使用Western blot檢測(cè)HDM是否通過(guò)MAPK通路引起lfTSLP的增高。
　　1.5.使用Western blot、TER、

5、FITC和免疫熒光檢測(cè)lfTSLP對(duì)氣道上皮細(xì)胞屏障的直接影響及STAT5信號(hào)通路在這個(gè)過(guò)程中的作用。
　　1.6.使用Western blot、TER、FITC和免疫熒光檢測(cè)sfTSLP對(duì)HDM和lfTSLP誘導(dǎo)的氣道上皮屏障的破壞的影響。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　2.1.BALB/c小鼠60只，隨機(jī)分為:(1)control(2)1，25D3(3) sfTSLP(4) HDM(5)1,25D3+HDM(6)sfTS

6、LP+HDM。所有小鼠每周連續(xù)5天進(jìn)行相應(yīng)處理，進(jìn)行8周。
　　2.2.小鼠完成最后一次操作24小時(shí)后進(jìn)行動(dòng)物無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)小鼠氣道反應(yīng)性，收集血清使用ELISA檢測(cè)IgE;收集小鼠的肺泡灌洗液檢測(cè)IFN-γ、 IL-4、IL-5、IL-13、IL-33、TSLP(lfTSLP)。
　　2.3.取出小鼠左肺進(jìn)行HE染色和E-cadherin、β-catenin和lfTSLP的免疫組織化學(xué)染色;取出小鼠右肺組織提取全肺蛋白，使

7、用Western blot檢測(cè)目的蛋白。
　　3.應(yīng)用SPSS19.0分析數(shù)據(jù)。
　　研究結(jié)果:
　　1.在16HBE細(xì)胞中，HDM上調(diào)lfTSLP的表達(dá)和破壞氣道上皮屏障。
　　2.在16HBE細(xì)胞中，1，25D3上調(diào)sfTSLP的表達(dá)和抑制了HDM所導(dǎo)致的氣道上皮屏障的破壞。
　　3.在16HBE細(xì)胞中，HDM通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路導(dǎo)致lfTSLP的上調(diào)。
　　4.在16HBE細(xì)胞中，lfTSL

8、P通過(guò)激活STAT5信號(hào)通路破壞氣道上皮屏障。
　　5.在16HBE細(xì)胞中，sfTSLP可以保護(hù)HDM和lfTSLP導(dǎo)致的氣道上皮屏障的破壞。
　　6.在HDM導(dǎo)致的哮喘小鼠模型中，1，25D3和sfTSLP通過(guò)抑制ERK和p38信號(hào)通路來(lái)保護(hù)HDM所致的氣道炎癥和氣道屏障蛋白的破壞。
　　研究結(jié)論:
　　1.HDM可通過(guò)ERK和p38信號(hào)通路的磷酸化促進(jìn)lfTSLP的表達(dá)，而高表達(dá)的lfTSLP可通過(guò)激活STA