血管緊張素Ⅱ及其受體在哮喘氣道重塑中的作用及機制探討.pdf

1、第一部分 血管緊張素Ⅱ及其受體在哮喘大鼠肺組織的表達(dá)及其與氣道炎癥和重塑的關(guān)系 目的：了解血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及其受體在哮喘大鼠肺組織的表達(dá)及其與哮喘氣道炎癥和氣道重塑的關(guān)系。 方法：隨機將20只Wistar大鼠分為對照組和哮喘組兩組，每組10只。采用OVA腹腔注射致敏、長時間反復(fù)OVA霧化吸入復(fù)制慢性哮喘動物模型。觀察大鼠哮喘發(fā)作癥狀；應(yīng)用動物肺功能儀測定大鼠氣道反應(yīng)性(以呼氣相氣道阻力(Re)表示)；支氣

2、管肺泡灌洗液(BALF)作細(xì)胞總數(shù)、分類計數(shù)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測BALF上清中TGF-β1、PDGF、VEGF含量；放射免疫分析法(RIA)檢測BALF上清中AngⅡ水平；常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大體組織病變和炎癥細(xì)胞浸潤；免疫組織化學(xué)檢測α-SMA染色陽性細(xì)胞；應(yīng)用圖像分析軟件測量大鼠氣道形態(tài)學(xué)變化。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測肺組織血管緊張素Ⅱ受體(AGTR)mRNA表達(dá)；蛋白質(zhì)印跡分析(West

3、ern blot analysis)AGTR和STAT-3蛋白水平。 結(jié)果：與對照組相比，哮喘組BALF中細(xì)胞總數(shù)以及中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞比例增加(p<0.05)，BALF中TGF-β1、PDGF、VEGF含量明顯增高(p<0.05～<0.01)；哮喘組較對照組呼氣阻力(Re)明顯增高(P<0.05～0.01)；在小氣道水平，哮喘組氣道管壁面積/管腔內(nèi)周長(WAt/Pi)、管壁平滑肌面積/管腔內(nèi)周長(WAm/ Pi)和α-S

4、MA陽性細(xì)胞面積/Pi均明顯大于對照組(P均<0.01)。同時，哮喘組BALF中AngⅡ含量高于對照組，哮喘大鼠肺組織AngⅡ受體(AGTRl，AGTR2)mRNA表達(dá)和蛋白水平明顯增強(p<0.01)；肺組織STAT3蛋白表達(dá)水平在哮喘組明顯增高(p<0.01)。大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)與Ang Ⅱ含量和肺組織AGTRlmRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，r=0.523、0.724，P<0.05-0.01；大鼠小氣道Wat/Pi與肺組織AGTRl

5、 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，r=0.671，P<0.05。 結(jié)論：大鼠肺組織局部存在血管緊張素系統(tǒng)，Ang II及其受體可能參與了哮喘氣道炎癥和氣道重塑。 第二部分血管緊張素1I受體拮抗劑對哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響 目的：觀察血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦對哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響。 方法：隨機將50只Wistar大鼠分為對照組、哮喘組、纈沙坦干預(yù)組C1、C2、C3組，共5組，纈沙坦干預(yù)組(

6、C1、C2、C3組)和哮喘組予OVA致敏和霧化吸入，霧化吸入隔天1次×30天，C1、C2、C3組分別于每次霧化吸入前60 min予纈沙坦15 mg·kg-1·d-1、30 mg·kg-1·d-1、50 mg·kg-1·d-1灌胃。動物肺功能儀測定大鼠氣道反應(yīng)性；BALF作細(xì)胞分類計數(shù)；ELIsA檢測BALF上清中TGF-β1、PDGF、VEGF含量;RIA檢測BALF上清中AngⅡ水平；免疫組織化學(xué)檢測α-SMA染色陽性細(xì)胞；圖像分析軟

7、件測量大鼠氣道形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果：纈沙坦明顯降低哮喘大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)以及中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞比例(P<0.05～<0.01)，減少BALF中TGF-β1、PDGF、VEGF含量(P<0.05～<0.01)；纈沙坦干預(yù)各組氣道反應(yīng)性明顯低于哮喘組(p<0.05～<0.01)；纈沙坦干預(yù)組的C2和C3組WAt/Pi較哮喘組明顯減少(p<0.05)；纈沙坦干預(yù)各組(C1、C2、C3組)α-SMA陽性面積/Pi在中、小氣道明顯

8、低于哮喘組(P<0.05～0.01)。但BALF上清中Ang II水平隨纈沙坦劑量增加而升高。 結(jié)論：血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦可能具有抑制哮喘氣道炎癥和氣道重塑作用。 第三部分纈沙坦對哮喘大鼠肺組織血管緊張素Ⅱ及其受體表達(dá)的影響 目的：觀察血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦對哮喘大鼠肺組織中血管緊張素Ⅱ及其受體表達(dá)的影響。 方法：隨機將50只Wistar大鼠分為對照組、哮喘組、纈沙坦干預(yù)組C1、C2、C3組

9、，共5組，纈沙坦干預(yù)組(C1、C2、C3組)和哮喘組予OVA致敏和霧化吸入，霧化吸入隔天1次×30天，C1、C2、C3組分別于每次霧化吸入前60 min予纈沙坦15 mg·kg-1·d-1、30 mg·kg-1·d-1、50 mg·kg-1·d-1灌胃。RIA檢測BALF上清和血清中AngⅡ含量；RT-PCR檢測肺組織TGF-β1mRNA、VEGF rnRNA、AGTRl mRNA和AGTR2 mRNA表達(dá)；Western Blot A

10、nalysis檢測AGTR和STAT3蛋白水平；原位雜交法檢測AGTR1和ATGR2 mRNA在肺組織中分布和表達(dá)。 結(jié)果：纈沙坦干預(yù)組的C2組、C3組AngⅡ高于對照組和哮喘組，尤以C3組增高最為明顯(p<0.01)。哮喘組AGTR1 mRNA表達(dá)明顯高于對照組(p<0.01)，而纈沙坦干預(yù)組(C1、C2、C3組)AGTRl mRNA表達(dá)低于哮喘組(p<0.01)；對照組和C1組AGTR2 mRNA表達(dá)明顯低于哮喘組，C2、C

11、3組AGTR2 mRNA表達(dá)高于對照組和C1組，但明顯低于哮喘組(p<0.05～0.01)。Western blot分析顯示AGTR1蛋白水平結(jié)果與AGTRl mRNA一致(P<0.01)，但AGTR2蛋白水平在對照組和C1組未檢測到，哮喘組AGTR2蛋白水平增高，C2、C3組AGTR2蛋白水平低于哮喘組(p<0.05)。原位雜交法檢測顯示AGTRlmRNA表達(dá)在哮喘組明顯強于對照組和纈沙坦干預(yù)組，AGTR2mRNA在哮喘組和纈沙坦干預(yù)

12、組C3的表達(dá)明顯強于對照組和纈沙坦干預(yù)組C1、C2。哮喘組TGF-β1 mRNA和VEGF mRNA明顯高于對照組(p<0.01)，纈沙坦干預(yù)組(C1、C2、C3組)兩者的表達(dá)則低于哮喘組(p<0.01)。哮喘組STAT3蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P<0.01)，纈沙坦干預(yù)組(C1、C2、C3組)STAT3低于哮喘組(p<0.01)。哮喘大鼠肺組織AGTRl mRNA表達(dá)隨纈沙坦劑量增大而減弱，與纈沙坦劑量呈負(fù)相關(guān)，r=-0.775，P<

13、0.01。 結(jié)論：Ang Ⅱ通過AGTRl參與哮喘氣道炎癥和氣道重塑，刺激細(xì)胞因子TGF-β1、VEGF、PDGF和信號分子STAT3分泌和表達(dá)可能是其部分作用機制。纈沙坦通過阻斷AGTRl減輕哮喘的氣道病變，其部分機制可能與纈沙坦下調(diào)AGTRl表達(dá)，降低AngⅡ生物學(xué)效應(yīng)，引起反應(yīng)性Ang Ⅱ濃度升高有關(guān)，高水平的Ang Ⅱ激動了AGTR2，使AGTR2表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生潛在的氣道保護(hù)作用。 第四部分血管緊張素Ⅱ?qū)θ梭w氣道

14、平滑肌細(xì)胞增殖的影響及纈沙坦的干預(yù) 目的：觀察Ang Ⅱ?qū)θ梭w氣道平滑肌細(xì)胞(HASMC)增殖的影響以及纈沙坦的抑制作用。 方法：體外原代培養(yǎng)HASMC，傳代后給予不同濃度Ang Ⅱ和組織胺(His)刺激，用纈沙坦對AngⅡ和His作用的HASMC進(jìn)行干預(yù)。以四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測定細(xì)胞周期和caspase-3表達(dá)。 結(jié)果：(1)MTT法顯示，AngⅡ組的吸光度(A57

15、0)和生長率明顯高于對照組和纈沙坦單藥組，以Ang Ⅱ10-5mol/L濃度在第24h為明顯(p<0.01)。AngⅡ+纈沙坦組的A570和生長率明顯低于AngⅡ組，纈沙坦的抑制作用在第24h時最為明顯(p<0.01)，且表現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系，以纈沙坦10-3mol/L的抑制作用最為明顯。(2)FCM分析，與對照組相比較，Ang Ⅱ10-5mol/L組和His10-2 mol/L組的S期百分率明顯升高(p<0.05～0.01)；Ang

16、 Ⅱ+纈沙坦組與Ang Ⅱ組相比，S期百分率呈劑量依賴性降低(p<0.05)，可以看出纈沙坦抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HASMC增殖；His+纈沙坦組與His組相比，顯示了和AngⅡ+纈沙坦組與AngⅡ組類似的結(jié)果(p<0.05～0.01)，提示纈沙坦也可以抑制His誘導(dǎo)的HASMC增殖。(3)AmgⅡ+纈沙坦組caspase-3蛋白表達(dá)強于Amg Ⅱ組。 結(jié)論：AngⅡ＃fHASMC有刺激增殖作用，纈沙坦對AngⅡ誘導(dǎo)的HASMC增殖