哮喘豚鼠氣道上皮損傷機(jī)制及還原型谷胱甘肽的保護(hù)作用.pdf

1、背景與目的:
　　支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是最常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病之一，不僅嚴(yán)重影響個(gè)人健康，而且造成了巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)。流行病資料顯示近20多年來(lái)哮喘患病率在世界大部分地區(qū)正以驚人的速度上升，已成為全球關(guān)注的公眾健康問(wèn)題。在我國(guó)，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和生存環(huán)境的改變，以及人們生活模式和飲食結(jié)構(gòu)的變化，支氣管哮喘的患病率也與日俱增，1990年我國(guó)城市0～14歲兒童哮喘患病率為0.9％，2000年平均累計(jì)患病率達(dá)1.5％，10年間上升了6

2、4.8％以上，成人患病率亦高達(dá)1.0％左右。如此高的患病率對(duì)哮喘的防治提出了更高的要求。在這樣的背景下，2012年全球支氣管哮喘防治創(chuàng)議(GINA)將哮喘定義為:哮喘是由多種細(xì)胞包括氣道的炎性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞（如嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等）和細(xì)胞組分(Cellularwlements)參與的氣道慢性炎癥性疾病。
　　目前，在哮喘研究上還面臨著諸多問(wèn)題，特別是哮喘發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及到多

3、種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞組分，除嗜酸細(xì)胞和肥大細(xì)胞是最重要的效應(yīng)細(xì)胞，T細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子起到調(diào)控作用，樹(shù)突狀細(xì)胞的作用是將變應(yīng)原呈遞給炎癥細(xì)胞，這些炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子構(gòu)成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，它們之間的相互作用、彼此影響和調(diào)控。其中，炎癥因子:IL-4、5、8，TNF-α和INF-γ等炎癥因子，均參與了哮喘的發(fā)生和發(fā)作，各種細(xì)胞之間的相互作用是通過(guò)細(xì)胞因子或某些神經(jīng)介質(zhì)完成，而這些細(xì)胞因子又通過(guò)不同機(jī)制引起更多的炎細(xì)胞聚集，進(jìn)一步

4、加重氣道的損傷，最后出現(xiàn)氣道重構(gòu)，這種在慢性炎癥刺激下發(fā)生的氣道壁結(jié)構(gòu)的改變，涉及細(xì)胞外基質(zhì)聚積、氣道平滑肌增厚與上皮下纖維化、肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast)增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生與腺體肥大等等，其中以基底膜下Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原纖維、纖維連接素等呼吸道細(xì)胞外基質(zhì)沉積和成纖維細(xì)胞活化、增殖表現(xiàn)最明顯，最終導(dǎo)致哮喘的頑固性反復(fù)發(fā)作，影響肺功能。
　　正常情況下，機(jī)體有完善的抗氧化系統(tǒng)，體內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生與消

5、除處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，然而，在哮喘氣道中，在活性氧和抗氧化劑精確的平衡被破壞的原因是ROS過(guò)量產(chǎn)物。這種失衡也可能是抗氧化劑的耗竭所致，它的影響是在整個(gè)氣道內(nèi)襯液和細(xì)胞外空間產(chǎn)生更多的氧化環(huán)境，大量流行病學(xué)和臨床證據(jù)支持增加ROS與哮喘發(fā)病機(jī)制的聯(lián)系。與正?？刂苹颊呦啾龋谙∪怂杉纳飿颖景l(fā)現(xiàn)較高水平氧化應(yīng)激增高的分子。另有研究表明哮喘病人氧化應(yīng)激的增強(qiáng)與肺功能減退有關(guān)。盡管這些發(fā)現(xiàn)，關(guān)于氧化應(yīng)激的增強(qiáng)是起到慢性炎癥的結(jié)果，還

6、是變應(yīng)性炎癥發(fā)展的的主要原因，這一點(diǎn)仍然不清楚。此外，氧應(yīng)激狀態(tài)可能是細(xì)胞凋亡發(fā)生的一個(gè)重要媒介，許多凋亡刺激伴有氧化應(yīng)激，而許多凋亡的抑制劑具有抗氧化活性或加強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力。研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者氣道上皮細(xì)胞凋亡存在不同程度異常，Bucchieri等通過(guò)對(duì)哮喘患者進(jìn)行肺部活檢發(fā)現(xiàn)其氣道上皮細(xì)胞凋亡增加，同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)也證明，在強(qiáng)氧化劑的作用下哮喘患者的氣道上皮細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。但氧化應(yīng)激與氣道上皮細(xì)胞的凋亡及哮喘反復(fù)發(fā)作的關(guān)系尚無(wú)定論。

7、
　　機(jī)體存在的兩大抗氧化系統(tǒng)，其一，過(guò)氧化物歧化酶(SOD)包含一個(gè)18個(gè)氨基酸的羥基末端區(qū)域包含有6個(gè)正電荷的氨基酸，在肺細(xì)胞外空間這個(gè)正電荷區(qū)域使SOD結(jié)合至肝素和其它負(fù)電荷分子上。主要在氣道和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，存在每個(gè)組織的細(xì)胞中，通過(guò)將過(guò)氧化基團(tuán)轉(zhuǎn)變成過(guò)氧化氫減少氧化劑負(fù)荷，從而起到抗氧化作用。而型谷胱甘肽(ReducedGlutathione，GSH)是一個(gè)包括巰基的三肽（左旋谷氨酰半胱氨酸-甘氨酸），是另一個(gè)重要的有保護(hù)

8、作用的抗氧化劑，具有抗自由基和其它氧化劑的作用。它的作用包括調(diào)節(jié)氧化還原信號(hào)的傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，重塑細(xì)胞外基質(zhì)，屏蔽抗蛋白酶、細(xì)胞調(diào)亡和線粒體呼吸。谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)保持動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能是非常重要的，是肺組織細(xì)胞中提供了最重要的抗氧化劑防御系統(tǒng)。小樣本的臨床對(duì)照研究顯示，還原型谷胱甘肽具有穩(wěn)定氣道上皮細(xì)胞，減輕哮喘的作用，其機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)。
　　絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activ

9、atedProteinKinases，MAPK)家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是一個(gè)非常保守的信號(hào)系統(tǒng)，存在于從酵母到哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中。p38MAPK是其家族中的一個(gè)成員，能被炎癥、應(yīng)激、損傷啟動(dòng)的信號(hào)激活，參與細(xì)胞的炎癥和凋亡[5，6]。支氣管哮喘炎癥反應(yīng)是否通過(guò)MAPK通路激活的上皮凋亡尚未可知。糖皮質(zhì)激素治療已經(jīng)被證明在大多數(shù)情況下能很好地控制氣道炎癥，但對(duì)氣道重塑特別是氣道上皮細(xì)胞凋亡的作用仍然是有爭(zhēng)議的。
　　對(duì)象與方法:
　　

10、1、建立哮喘豚鼠模型:清潔級(jí)健康雄性豚鼠48只，體重450±25g，隨機(jī)分組后，參照目前國(guó)內(nèi)外通用方法制作:，于第1、8天分別腹腔注射2％卵蛋白2ml;第21天將單只豚鼠置于半封閉的容器中超聲霧化吸人2％卵蛋白5分鐘誘喘。如該豚鼠出現(xiàn)劇烈咳嗽、打噴嚏、呼吸困難、喘息、呼氣費(fèi)力或點(diǎn)頭樣呼吸，聽(tīng)診聞及喘鳴音，這表明哮喘模型制作成功。
　　2、干預(yù)措施和評(píng)估方法:建立支氣管哮喘豚鼠模型后，收集肺泡灌洗液和肺組織標(biāo)本，檢測(cè)肺泡灌洗液的白細(xì)

11、胞及分類、細(xì)胞因子的分布情況，同時(shí)檢測(cè)肺組織的光鏡病理改變，并檢測(cè)相關(guān)炎癥因子。然后，以還原型谷胱甘肽為干預(yù)藥物，探索GSH對(duì)支氣管哮喘上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及可能機(jī)制，最后通過(guò)分組分析比較，揭示MAPK通路在炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的哮喘氣道上皮細(xì)胞凋亡中的作用和影響。
　　3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0分析軟件進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料用(x)±s表示，樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析(one-wayANOVA)，兩兩比較采

12、用LSD檢驗(yàn);相關(guān)分析采用檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.第一部分中:模型組豚鼠進(jìn)食減少，生長(zhǎng)緩慢，精神萎靡，活動(dòng)量減少，行動(dòng)遲緩，口唇發(fā)紺。與正常對(duì)照組相比，模型組BALF中嗜酸性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均有P＜0.001)。光鏡顯示模型組管腔周?chē)写罅垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，支氣管粘膜有破壞現(xiàn)象，部分剝蝕，纖毛細(xì)胞損失，平滑肌斷裂，基底膜破壞，管腔內(nèi)粘液和細(xì)胞團(tuán)塊堆積。與正常對(duì)照組相比，模型組

13、SOD測(cè)定顯著降低（124.69±17.64vs164.87±22.35P＜0.0001），T-AOC亦顯著低于對(duì)照組（6.94±1.58vs19.43±5.84P＜0.0001）。而ROS測(cè)定結(jié)果顯著高于對(duì)照組(27.31±4.77vs7.24±1.64P＜0.0001)。氣道上皮細(xì)胞進(jìn)行TUNEL染色后，模型組凋亡的平均比例為34.13±4.67％，顯著高于對(duì)照組的2.12±0.84％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=61.20，P＜0.0

14、01)。進(jìn)一步的相關(guān)分析顯示:上皮細(xì)胞凋亡比例與肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞數(shù)成正相關(guān)關(guān)系（r=0.792，P=0.002和r=0.746，P=0.005。），分別有r=-0.651，P=0.004和r=-0.507，P=0.017，與SOD、T-AOC呈負(fù)相關(guān)，而與ROS呈正相關(guān)。
　　2.第二部分:還原型谷胱甘肽組和地塞米松組豚鼠性狀較模型組輕，存在一定程度的精神萎靡，活動(dòng)量減少，行動(dòng)遲緩，但無(wú)口唇發(fā)紺現(xiàn)象。各組豚鼠支氣

15、管肺泡灌洗液嗜酸性粒細(xì)胞存在整體差異(F=168.326，P＜0.001)，模型組嗜酸性粒細(xì)胞比例最高。還原性谷胱甘肽組BALF中嗜酸性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均有P＜0.001）。谷胱甘肽組和地塞米松組肺泡灌洗液中TNF-α顯著低于模型組(P＜0.001)，而INF-γ水平顯著高于模型組(P＜0.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。光鏡顯示谷胱甘肽組支氣管周炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)較輕，上皮細(xì)胞較完整，基底膜破壞相對(duì)較輕。

16、在肺組織GSH的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽組豚鼠肺組織GSH水平接近正常對(duì)照組，顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），而γ-GCS和TNF-α陽(yáng)性區(qū)光密度面積顯著低于模型組（均有P＜0.001）。在對(duì)凋亡的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，各組豚鼠氣道上皮細(xì)胞均存在不同程度的凋亡現(xiàn)象，還原型谷胱甘肽組和地塞米松組豚鼠T-AOC水平接近正常對(duì)照組，而顯著高于模型組(P＜0.05)。電鏡觀察顯示:模型組支氣管上皮細(xì)胞重度腫脹，電子密度降低，細(xì)胞膜溶解、

17、消失，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容溢出，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失。谷胱甘肽組支氣管上皮細(xì)胞呈單層柱狀排列，纖毛細(xì)胞核圓形居中，核內(nèi)常染色質(zhì)豐富，電子密度降低。
　　3.第三部分:大體觀察地塞米松和SB203580干預(yù)組未見(jiàn)肺膨隆，但局部稍充血，表面基本光滑。光鏡下，哮喘組豚鼠肺組織病理變化（支氣管周炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道上皮細(xì)胞脫落、氣道平滑肌增殖、黏液栓塞以及杯狀細(xì)胞肥大等）、氣道上皮細(xì)胞凋亡(cleavedcaspase-3染色陽(yáng)性細(xì)胞)、肺組織磷酸化p38M

18、APK表達(dá)水平及BALF中IL-4含量正常對(duì)照組顯著增加(P＜0.01)，肺組織磷酸化p38MAPK表達(dá)水平、BALF中IL-4含量呈顯著正相關(guān)(r=0.77、0.63，P＜0.01);DEX干預(yù)組上述指標(biāo)較哮喘組顯著降低(P＜0.01)，肺組織病理學(xué)損傷程度明顯減輕;SB203580組豚鼠肺組織病理變化、氣道上皮細(xì)胞凋亡、肺組織磷酸化p38MAPK表達(dá)水平較哮喘組顯著降低（P＜0.01），而B(niǎo)ALF中IL-4含量較哮喘組降低無(wú)顯著意義