MicroRNA-203通過(guò)PDPN抑制下咽癌的生長(zhǎng)及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、背景:
　　下咽癌(Hypopharyngeal cancer)是人頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤之一。這些年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)以及手術(shù)技術(shù)水平的提高，還有放療、化療、生物治療等綜合治療水平的發(fā)展，患者的生存率卻依然很低。據(jù)國(guó)外報(bào)道5年生存率僅為15％-30％。首要的原因是下咽癌患者就診時(shí)有很大一部分已經(jīng)是中晚期了，很多已經(jīng)有頸部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移或鄰近部位的侵犯，這主要與該疾病的發(fā)病位置隱秘，不易早期被注意到有關(guān)。其次是因?yàn)樵撃[瘤極易轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)

2、，這也是治療失敗的主要原因。下咽癌的解剖部位注定了其對(duì)患者的生活質(zhì)量、社會(huì)交流等重要方面會(huì)產(chǎn)生深刻的影響。如果腫瘤復(fù)發(fā)，對(duì)患者的生存、生活、家庭、經(jīng)濟(jì)等各個(gè)方面都會(huì)產(chǎn)生巨大的消極負(fù)面影響。如果可以早發(fā)現(xiàn)、早治療，將有效的改善下咽癌患者的預(yù)后。由此可見(jiàn)，探尋下咽癌增殖轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制以及與之相關(guān)聯(lián)的腫瘤因子，對(duì)于臨床工作及患者預(yù)后具有十分重要的意義。
　　腫瘤的形成是在一系列突變基因疊加共同作用的、多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程。首先在多種

3、類型的癌前組織中，某部分的基因發(fā)生突變，導(dǎo)致這些細(xì)胞獲得單克隆或多克隆的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，繼而加上原癌基因、抑癌基因和DNA修復(fù)相關(guān)基因等發(fā)生一系列突變，更進(jìn)一步促使癌前細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞，進(jìn)而形成原發(fā)腫瘤。所謂惡性腫瘤，特點(diǎn)是脫離了原發(fā)的病灶，發(fā)生遠(yuǎn)處的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移。隨著科技的進(jìn)步，人們對(duì)miRNAs的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中其發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。
　　微小RNA(miRNAs)是一類動(dòng)、植物以及病毒內(nèi)都普遍存在的，包含

4、21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，與腫瘤的形成及發(fā)展密切相關(guān)。有些mi RNA具有致癌基因的功能，大部分具有抑制腫瘤的活性的功能。miRNAs可以識(shí)別特定的靶mRNA并與之結(jié)合，之后在轉(zhuǎn)錄后水平抑制翻譯過(guò)程和/或促進(jìn)靶基因mRNA的降解，以此來(lái)發(fā)揮其負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)的作用。
　　目前已知的miRNAs已經(jīng)達(dá)到千余種。miR-203是miRNAs中的重要一員，具有在上皮組織中特異性表達(dá)的特點(diǎn)，其在不同組織來(lái)源的惡性腫瘤中的

5、表達(dá)有顯著差別。miR-203基因序列定位于染色體上的不穩(wěn)定脆性區(qū)域——14q32.33上，含有52種miRNA基因序列，參與編碼人類目前已知約12％的miRNA。miR-203廣泛地分布于人體的各種組織器官，但是具有組織分布差異性。miR-203在控制細(xì)胞增殖、凋亡、分化、祖細(xì)胞的干細(xì)胞潛力、應(yīng)激反應(yīng)、上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、細(xì)胞侵襲和遷移過(guò)程中發(fā)揮相關(guān)功能。目前研究人員已經(jīng)證明miR-203在一部分腫瘤中發(fā)揮抑癌微小RNA的

6、作用。但是其在下咽癌中的作用特別是對(duì)下咽癌增殖轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響尚不清楚。
　　平足蛋白/淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白(Podoplanin，PDPN)是我們本次實(shí)驗(yàn)鑒定出的miR-203的一個(gè)靶基因。平足蛋白是一個(gè)小的具有大量O-糖鏈的細(xì)胞膜糖蛋白，屬于黏蛋白家族。主要存在于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞、Ⅰ型肺泡壁細(xì)胞和腎小球足細(xì)胞。人類很多腫瘤中發(fā)現(xiàn)平足蛋白水平升高或表達(dá)增加。在大多數(shù)腫瘤中，腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞平足蛋白表達(dá)水平的升高與淋巴轉(zhuǎn)移發(fā)生率增加

7、和病人生存期縮短有關(guān)。平足蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但對(duì)PDPN在下咽癌疾病中的研究則非常有限。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)miR-203和PDPN在下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者的臨床預(yù)后之間的相關(guān)性尚有待研究。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法，測(cè)定miR-203和PDPN在人下咽組織和正常黏膜組織中的表達(dá)情況，分析miR-203和PDPN與下咽鱗癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。同時(shí)

8、應(yīng)用體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)miR-203和PDPN對(duì)FaDu細(xì)胞增殖、遷移及侵襲功能的影響，進(jìn)一步研究?jī)烧叩纳飳W(xué)特性和相互作用。以期可以為下咽癌提供早期診斷和預(yù)后判斷的分子生物學(xué)指標(biāo)，并可以為下一步的腫瘤靶向治療提供研究方向。
　　本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-203在下咽癌組織中的表達(dá)情況，研究了miR-203通過(guò)調(diào)控靶基因PDPN在下咽癌的轉(zhuǎn)移及增殖中起的作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。
　　第一部分:miR-203在下咽癌的表達(dá)及其對(duì)

9、下咽癌發(fā)展的影響
　　目的:
　　1.研究下咽癌組織中miR-203的表達(dá)情況以及miR-203的表達(dá)量與腫瘤T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　2.研究miR-203對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞系增殖、遷移及侵襲的影響。
　　方法:
　　以49例人下咽癌組織及18例正常咽腔黏膜組織為樣本，qRT-PCR（實(shí)時(shí)定量PCR）法檢測(cè)各樣本中miR-203的表達(dá)。將腫瘤不同分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的各組加以比較分析。再以下咽癌F

10、aDu細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)包病毒實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染miR-203或miR-NC慢病毒建立穩(wěn)定細(xì)胞系。然后經(jīng)qRT-PCR法檢測(cè)miR-203的表達(dá)。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。運(yùn)用傷口愈合實(shí)驗(yàn)及體外侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-203過(guò)表達(dá)的細(xì)胞與miR-NC過(guò)表達(dá)的細(xì)胞相比，細(xì)胞遷移及侵襲能力的改變。
　　結(jié)果:
　　miR-203在正常咽腔黏膜組織中的表達(dá)水平顯著高于在下咽癌組織

11、中的表達(dá)水平。miR-203表達(dá)強(qiáng)度隨著下咽癌組織T分期的增高而降低。同時(shí)，通過(guò)對(duì)比淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及為轉(zhuǎn)移樣本中miR-203的表達(dá)，證實(shí)其低表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具顯著相關(guān)性。
　　在FaDu細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-203或miR-NC慢病毒建立穩(wěn)定細(xì)胞系，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)證實(shí)miR-203在miR-203過(guò)表達(dá)的細(xì)胞顯著上升。使用CCK-8每24 h檢測(cè)一次細(xì)胞活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)與miR-NC過(guò)表達(dá)細(xì)胞相比，miR-203過(guò)表達(dá)細(xì)胞

12、的細(xì)胞增殖活性顯著降低。同時(shí)，傷口愈合實(shí)驗(yàn)及體外侵襲實(shí)驗(yàn)均證實(shí)miR-203過(guò)表達(dá)的細(xì)胞與miR-NC過(guò)表達(dá)的細(xì)胞相比，細(xì)胞的遷移及侵襲能力均減弱。即高水平的miR-203抑制下咽癌細(xì)胞的增殖，遷移及侵襲。
　　結(jié)論:
　　1.miR-203在下咽癌組織中低表達(dá)，并且其表達(dá)水平與腫瘤的T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　2.miR-203可以抑制下咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。
　　第二部分:miR-203與PDPN

13、在下咽癌組織中的關(guān)系研究
　　目的:
　　1.證實(shí)PDPN為miR-203的靶基因，并探討兩者的關(guān)系。
　　2.探討PDPN在下咽癌組織的表達(dá)以及其表達(dá)量與腫瘤T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　3.沉默PDPN，進(jìn)行CCK-8細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)、傷口愈合實(shí)驗(yàn)及體外侵襲實(shí)驗(yàn)，證實(shí)PDPN對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞系增殖、遷移及侵襲功能的影響。
　　4.利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過(guò)比較miR-203過(guò)表達(dá)以及miR-NC過(guò)表達(dá)

14、的FaDu細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染空載與PDPN后細(xì)胞的增殖活性、遷移及侵襲功能，探討PDPN和miR-203的相互作用。
　　方法:
　　通過(guò)硅片檢測(cè)，使用TargetScan Release7.1分析，鑒別出miR-203結(jié)合的PDPN的3'-UTR位點(diǎn)。之后根據(jù)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因，包括野生型及突變型。以下咽癌FaDu細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，檢測(cè)PDPN報(bào)告基因野生型及突變型的相對(duì)活性。使用qRT-PCR法檢測(cè)正常咽

15、腔黏膜組織及人下咽癌組織樣本中PDPN的表達(dá)。運(yùn)用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)在miR-203過(guò)表達(dá)與陰性對(duì)照組中PDPN的表達(dá)水平。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。運(yùn)用傷口愈合實(shí)驗(yàn)及體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PDPN在各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中對(duì)細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:
　　miR-203結(jié)合PDPN的位點(diǎn)在3'-UTR區(qū)內(nèi)。在miR-203過(guò)表達(dá)細(xì)胞中，野生型PDPN的報(bào)告基因活性很低，而突變型PDPN的報(bào)告基因活性在mi

16、R-203過(guò)表達(dá)細(xì)胞、miR-NC對(duì)照細(xì)胞中一致。人下咽腫瘤樣本中PDPN的表達(dá)水平大量超出在正常咽腔黏膜樣本中的表達(dá)水平，同時(shí)PDPN表達(dá)水平的上升與癌癥T分期的上升及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析表明人下咽腫瘤樣本中PDPN與miR-203的表達(dá)水平具負(fù)相關(guān)。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)與miR-NC對(duì)照組相比，PDPN的表達(dá)水平在miR-203過(guò)表達(dá)細(xì)胞中下調(diào)。
　　與轉(zhuǎn)染空載比較，F(xiàn)aDu細(xì)胞轉(zhuǎn)染PDPN shRNA后PDPN

17、表達(dá)降低。CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)證實(shí)，與轉(zhuǎn)染空載比較，PDPN敲除細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著降低。此外，傷口愈合實(shí)驗(yàn)及體外侵襲實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照相比PDPN敲除的FaDu細(xì)胞系遷移及侵襲速度明顯降低。
　　蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與miR-NC+空載組及miR-203+PDPN組相比，PDPN的表達(dá)水平在miR-203+空載組中下調(diào)。CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)同樣證實(shí)miR-203+空載組細(xì)胞活性顯著降低。相應(yīng)的進(jìn)行傷口愈合實(shí)驗(yàn)及體外侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)

18、miR-203+空載組的細(xì)胞的遷移及侵襲速度相比于miR-NC+空載組及miR-203+PDPN組降低。
　　結(jié)論:
　　1.PDPN是miR-203的直接下游靶基因。PDPN為重要的原癌基因，其高表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　2.PDPN作為原癌基因促進(jìn)下咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。miR-203可抑制PDPN在下咽癌細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3.PDPN過(guò)表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-203對(duì)下咽癌細(xì)胞增殖，遷移