乏氧環(huán)境下LOXL-2刺激MSC活化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞促進(jìn)MPN骨髓纖維化進(jìn)程研究.pdf

1、慢性髓系白血病(CML)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)、真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)等MPN病程進(jìn)展中常伴隨骨髓纖維化。進(jìn)行性骨髓纖維化亦是影響MPN向白血病、骨髓衰竭演變的高危因素。因此，研究發(fā)生骨髓纖維化的特異性細(xì)胞因子，可能為深入挖掘MPN的發(fā)病機(jī)制、尋找更有效的靶向治療提供新的切入點(diǎn)。
　　基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)骨髓微環(huán)境的動態(tài)演化參與了MPN骨髓纖維化進(jìn)程。骨髓微環(huán)境處于1％氧濃度左右的乏氧狀態(tài)，腫瘤中的乏

2、氧微環(huán)境可通過誘導(dǎo)新生血管形成、抑制免疫監(jiān)視和免疫反應(yīng)、孕育腫瘤干細(xì)胞等機(jī)制促進(jìn)腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)及進(jìn)展。
　　腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)是腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞的主要組成成分，在腫瘤生物行為學(xué)特征中起著至關(guān)重要的作用，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)作為骨髓微環(huán)境中的重要成分，是CAF重要來源。新近研究發(fā)現(xiàn)，乏氧微環(huán)境中增多的CAF與MPN纖維化進(jìn)程密切相關(guān)，但缺乏腫瘤細(xì)胞刺激的乏氧環(huán)境下將導(dǎo)致CAF的失活。表明CAF的活化需要通過與

3、腫瘤細(xì)胞或其分泌因子發(fā)生“互話”。然而，到底是哪些因素活化CAF促進(jìn)MPN骨髓纖維化尚不清楚。
　　賴氨酰氧化酶樣蛋白2(LOXL2)是賴氨酰氧化酶(LOX)家族成員之一，可通過激活FAK/Src、Erk信號通路、介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等方式參與多種惡性腫瘤侵襲性生物學(xué)特征形成。研究發(fā)現(xiàn)，LOXL2的表達(dá)水平與MPN纖維化程度密切相關(guān)。乏氧微環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞來源的LOXL2可激活FAK/Src信號通路促使纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CAF，后者分泌

4、多種細(xì)胞因子不斷促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移。但兩種因子介導(dǎo)骨髓纖維化機(jī)制目前尚不清楚。
　　結(jié)合研究現(xiàn)狀，我們推測，MPN病程中，微環(huán)境中的BMMSC可能活化為CAF表型促進(jìn)骨髓纖維化;而LOXL2則可能是乏氧微環(huán)境中促進(jìn)BMMSC活化為CAF的關(guān)鍵因子，進(jìn)一步推進(jìn)MPN骨髓纖維化進(jìn)程。
　　研究目的:
　　驗(yàn)證CAF及LOXL-2與MPN及骨髓纖維化進(jìn)展密切相關(guān);證實(shí)MPN來源的BMMSC活化為CAF表型促進(jìn)纖維化進(jìn)程;

5、探索乏氧環(huán)境下LOXL-2是否作為啟動因素刺激MSC活化為CAF，這種效應(yīng)是否能夠被LOX抑制劑所阻斷。
　　研究方法:
　　臨床標(biāo)本水平:
　　1.提取正常人與MPN患者骨髓單個核細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR及Western-blot方法檢測CAF標(biāo)志物（α-SMA、FAP）及LOXL2的表達(dá)水平。
　　2.收集正常人與MPN患者骨髓或外周血血清，應(yīng)用ELISA方法檢測LOXL2表達(dá)差異。
　　3.收集骨髓病理

6、活檢標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化檢測骨髓活檢中網(wǎng)染蛋白、α-SMA、FAP、LOXL2的表達(dá)情況。
　　細(xì)胞水平:
　　1.經(jīng)知情同意，取正常人及MPN患者骨髓分離培養(yǎng)BMMSC，觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測MSC生物學(xué)特性:免疫表型、成骨、成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力。應(yīng)用RT-PCR、Western blot分別檢測正常人與MPN患者α-SMA、FAP表達(dá)情況。
　　2.分別在正常氧和1％氧濃度條件下培養(yǎng)BMMSC24h、48h、72h、9

7、6h，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，檢測CAF標(biāo)志物α-SMA、FAP及p-FAK、p-SRC、FAK、SRC通路蛋白表達(dá)情況。
　　3.利用重組人LOXL2(rhLOXL2)刺激BMMSC24h、48h、72h、96h，檢測CAF標(biāo)志物α-SMA、FAP、通路蛋白表達(dá)變化。
　　4.應(yīng)用LOX抑制劑β-氨基丙腈處理上述組分，檢測CAF標(biāo)志物α-SMA、FAP及通路蛋白表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.臨床標(biāo)本水平檢測α-

8、SMA、FAP及LOXL2在MPN患者中表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，LOXL2在MPN骨髓或外周血血清中表達(dá)顯著高于正常人水平(P＜0.05)。
　　2.骨髓活檢免疫組化檢測結(jié)果顯示，a-SMA、FAP及LOXL2在正常人不表達(dá)或較低表達(dá)，在MPN患者中呈不同程度的表達(dá)，隨著纖維化程度的增加表達(dá)逐漸升高，在PMF嚴(yán)重纖維化(+++)患者中升高最顯著。
　　3.MPN患者BMMSC具有不同于正常人的生物學(xué)特征，其成骨分化能力

9、增強(qiáng)、成脂分化能力減弱;a-SMA、FAP在MPN患者BMMSC中表達(dá)較正常人明顯升高。
　　4.乏氧環(huán)境下單獨(dú)培養(yǎng)BMMSC，CAF表達(dá)逐漸降低，96h降低最明顯(P＜0.05);應(yīng)用rhLOXL2刺激后，a-SMA、FAP表達(dá)增高，96h升高最顯著(P＜0.05);進(jìn)一步應(yīng)用LOX抑制劑β-氨基丙腈處理rhLOXL2+MSC，a-SMA、FAP表達(dá)明顯下降(P＜0.05);相關(guān)通路蛋白檢測顯示，p-FAK、p-Src在rhLO

10、XL2刺激下表達(dá)升高，BAPN可削弱該通路蛋白表達(dá)。正常氧情況下培養(yǎng)的BMMSC，對rhLOXL2刺激不敏感，a-SMA、FAP表達(dá)水平變化不顯著。
　　研究結(jié)論:
　　1.腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、LOXL2與MPN及骨髓纖維化進(jìn)程密切相關(guān);
　　2.MPN患者BMMSC具有不同于正常人的生物學(xué)特征，在MPN骨髓微環(huán)境中獲得CAF表型;
　　3.乏氧環(huán)境下LOXL-2可能通過FAK/Src信號通路刺激BMMSC活化為