脾氣虛證大鼠小腸腸神經(jīng)-Cajal間質(zhì)細(xì)胞-平滑肌網(wǎng)絡(luò)損傷和針刺足三里、天樞穴修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：脾氣虛證（Syndrome of Deficiency of Spleen-Qi，SDSQ）是臨床上最常見(jiàn)的虛證之一，臨床上主要是以進(jìn)餐后胃部飽脹不適、消瘦乏力、倦怠易疲勞、面色枯黃無(wú)血色、大便稀溏等為臨床表現(xiàn)?，F(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)研究證實(shí)：脾氣虛證的主要表現(xiàn)是胃腸道運(yùn)動(dòng)功能、消化吸收功能、內(nèi)分泌功能和免疫功能等多系統(tǒng)、多因素的紊亂。然而消化道運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)是消化吸收功能、內(nèi)分泌和免疫功能低下等系統(tǒng)恢復(fù)的前提條件。胃腸道運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)既是

2、糾正胃腸道損害的最初始同時(shí)也是最關(guān)鍵的一步。促進(jìn)胃腸道動(dòng)力的治療能夠有效的治療胃腸道運(yùn)動(dòng)功能、消化吸收功能、內(nèi)分泌和免疫功能障礙等。所以說(shuō)，探討脾氣虛證胃腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙的本質(zhì)，研究治療脾氣虛證胃腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙的有效方法變得十分必要。針灸作為祖國(guó)醫(yī)學(xué)中一種傳統(tǒng)的治療方法，在中國(guó)應(yīng)用已有兩千多年的歷史。在臨床實(shí)踐中，越來(lái)越多的研究顯示，針刺足三里、天樞穴可以糾正胃腸道運(yùn)動(dòng)功能紊亂，有效的治療脾氣虛證，在治療功能性胃腸道疾病方面有著自己獨(dú)

3、特的優(yōu)勢(shì)，但確切的機(jī)制仍不十分清楚，需要進(jìn)一步的研究。
　　目的：通過(guò)苦寒瀉下結(jié)合耗氣破氣的方法建造脾氣虛證大鼠模型，以脾氣虛證大鼠小腸腸神經(jīng)-Cajal間質(zhì)細(xì)胞-平滑肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)為研究對(duì)象，觀察脾氣虛證大鼠小腸腸神經(jīng)-Cajal間質(zhì)細(xì)胞-平滑肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的損傷，研究脾氣虛證的發(fā)病機(jī)制。然后對(duì)脾氣虛證大鼠進(jìn)行針刺足三里、天樞穴進(jìn)行治療，觀察針灸對(duì)脾氣虛證大鼠小腸腸神經(jīng)-Cajal間質(zhì)細(xì)胞-平滑肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)損傷的修復(fù)作用，進(jìn)一步探索針刺足

4、三里、天樞穴治療脾氣虛證的作用機(jī)制。
　　方法：選取清潔級(jí)成年 Wistar大鼠，雌雄不限，參考中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院陳小野教授的方法，先通過(guò)體質(zhì)篩選，再采用苦寒瀉下結(jié)合耗氣破氣的方法建造脾氣虛證大鼠動(dòng)物模型。將大鼠分為對(duì)照組、模型組、自然恢復(fù)組、假針刺穴位組（針刺非經(jīng)非絡(luò)穴位組）、針刺天樞穴治療組、針刺足三里穴治療組、針刺足三里+天樞穴聯(lián)合治療組。造模成功及治療結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，打開(kāi)腹腔切取小腸的近幽門(mén)端用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)研

5、究分為以下三部分：第一部分、通過(guò)觀察一般行為學(xué)變化、監(jiān)測(cè)體重、測(cè)定尿D-木糖排泄率、大體解剖觀察、測(cè)定胃排空率、測(cè)定小腸推進(jìn)率、病理學(xué)HE染色觀察、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)、免疫熒光標(biāo)記激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)等方法來(lái)觀察脾氣虛證大鼠小腸腸神經(jīng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)學(xué)變化和針刺足三里、天樞穴的修復(fù)作用。第二部分、通過(guò)免疫熒光雙重標(biāo)記激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)的方法來(lái)觀察脾氣虛證大鼠小腸腸神經(jīng)-ICC之間的信號(hào)傳導(dǎo)通路的損傷和針刺足三里、天

6、樞穴的修復(fù)作用。第三部分、通過(guò)免疫組織化學(xué)、Westernblotting、qPCR等方法來(lái)觀察脾氣虛證大鼠小腸ICC-平滑肌之間的信號(hào)傳導(dǎo)通路的損傷和針刺足三里、天樞穴的修復(fù)作用。通過(guò)三部分實(shí)驗(yàn)來(lái)探索脾氣虛證所導(dǎo)致的胃腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙的實(shí)質(zhì)和針刺足三里、天樞穴治療脾氣虛證的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.與正常對(duì)照組相比，脾氣虛證模型組大鼠的一般行為學(xué)表現(xiàn)明顯變差，大體解剖肉眼觀察小腸蠕動(dòng)明顯緩慢，小腸組織HE病理學(xué)表現(xiàn)小

7、腸組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，ICC的超微結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，體重增長(zhǎng)明顯緩慢，尿D-木糖排泄率、胃排空率、小腸推進(jìn)率均明顯降低，腸神經(jīng)系統(tǒng)的PGP9.5神經(jīng)纖維、ACh神經(jīng)纖維、SP神經(jīng)纖維、VIP神經(jīng)纖維、NO神經(jīng)纖維、ICC、SMC、ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)的數(shù)量明顯減少，結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞（P<0.05），而模型組、自然恢復(fù)組、假針刺組三組之間相互比較，無(wú)明顯差異（P>0.05）。與模型組相比，天樞組、足三里組略有好轉(zhuǎn)（P<0.05），但天

8、樞組、足三里組兩組之間比較，無(wú)明顯差異（P>0.05）。與天樞組、足三里組相比，聯(lián)合治療組效果明顯好轉(zhuǎn)（P<0.05），但仍低于正常對(duì)照組（P<0.05）?？傮w來(lái)說(shuō)，其基本趨勢(shì)為：模型組≈自然恢復(fù)組≈假針刺組<天樞組≈足三里組<聯(lián)合組<正常組。
　　2.與正常對(duì)照組相比，脾氣虛證模型組大鼠小腸腸神經(jīng)-ICC之間的信號(hào)傳導(dǎo)通路，主要有ACh神經(jīng)纖維的M受體、SP神經(jīng)纖維的NK受體、NO神經(jīng)纖維的受體-鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（sGC）、VIP神

9、經(jīng)纖維的VPAC受體、PKA、PKC、cGK/PKG數(shù)量明顯減少，其信號(hào)通路G蛋白偶聯(lián)受體-cAMP-PKA途徑、G蛋白偶聯(lián)受體-磷脂酶C（PLC）-PKC途徑、sGC-cGMP-PKG途徑明顯遭到破壞（P<0.05），而模型組、自然恢復(fù)組、假針刺組三組之間相互比較，無(wú)明顯差異（P>0.05）。與模型組相比，天樞組、足三里組略有好轉(zhuǎn)（P<0.05），但天樞組、足三里組兩組之間比較，無(wú)明顯差異（P>0.05）。與天樞組、足三里組相比，聯(lián)合

10、治療組效果明顯好轉(zhuǎn)（P<0.05），但仍低于正常對(duì)照組（P<0.05）?？傮w來(lái)說(shuō)，其基本趨勢(shì)為：模型組≈自然恢復(fù)組≈假針刺組<天樞組≈足三里組<聯(lián)合組<正常組。
　　3.與正常對(duì)照組相比，脾氣虛證模型組大鼠小腸 ICC-平滑肌之間的信號(hào)傳導(dǎo)通路，主要是縫隙連接和縫隙連接蛋白43數(shù)量明顯減少，信號(hào)傳導(dǎo)途徑明顯破壞（P<0.05），而模型組、自然恢復(fù)組、假針刺組三組之間相互比較，無(wú)明顯差異（P>0.05）。與模型組相比，天樞組、足三里

11、組略有好轉(zhuǎn)（P<0.05），但天樞組、足三里組兩組之間比較，無(wú)明顯差異（P>0.05）。與天樞組、足三里組相比，聯(lián)合治療組效果明顯好轉(zhuǎn)（P<0.05），但仍低于正常對(duì)照組（P<0.05）?？傮w來(lái)說(shuō)，其基本趨勢(shì)為：模型組≈自然恢復(fù)組≈假針刺組<天樞組≈足三里組<聯(lián)合組<正常組。
　　結(jié)論：
　　1.脾氣虛證時(shí)，大鼠一般行為學(xué)表現(xiàn)明顯變差，體重增長(zhǎng)緩慢，尿D-木糖排泄率明顯降低，大體解剖觀察小腸蠕動(dòng)明顯緩慢，胃排空率明顯降低，小

12、腸推進(jìn)率明顯降低，小腸病理學(xué)HE染色觀察小腸組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，ICC超微結(jié)構(gòu)明顯破壞，小腸的PGP9.5神經(jīng)纖維、ACh神經(jīng)纖維、SP神經(jīng)纖維、NO神經(jīng)纖維、VIP神經(jīng)纖維、ICC、SMC數(shù)量明顯減少，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)明顯破壞。針刺足三里和天樞穴治療后，可明顯修復(fù)脾氣虛證的損傷，其基本趨勢(shì)為：模型組≈自然恢復(fù)組≈假針刺組<天樞組≈足三里組<聯(lián)合組<正常組。
　　2.脾氣虛證時(shí)，大鼠小腸腸神經(jīng)-ICC之間的信號(hào)傳導(dǎo)通路，主要有 ACh神經(jīng)纖

13、維的M受體、SP神經(jīng)纖維的NK受體、NO神經(jīng)纖維的受體-鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（sGC）、VIP神經(jīng)纖維的VPAC受體、PKA、PKC、cGK/PKG數(shù)量明顯減少，其信號(hào)通路G蛋白偶聯(lián)受體-cAMP-PKA途徑、G蛋白偶聯(lián)受體-磷脂酶C（PLC）-PKC途徑、sGC-cGMP-PKG途徑明顯破壞。針刺足三里和天樞穴治療后，可明顯修復(fù)脾氣虛證的損傷，其基本趨勢(shì)為：模型組≈自然恢復(fù)組≈假針刺組<天樞組≈足三里組<聯(lián)合組<正常組。
　　3.脾氣虛