針刺足三里、天樞穴修復(fù)脾氣虛證大鼠小腸膽堿能神經(jīng)和平滑肌細(xì)胞損傷研究.pdf

1、背景:脾氣虛證(Syndrome of Deficiency of Spleen-Qi，SDSQ)是中醫(yī)臟腑病辨證中的基本證型。主要臨床表現(xiàn)為食欲減退，食后或午后腹脹，大便塘薄，腹脹、納呆、便塘等，多由于飲食不節(jié)、勞倦過度、過食生冷、久病耗氣所引起。經(jīng)常見于中醫(yī)的腹痛、下瀉、水腫、痰飲、哮喘、痿證、胃脘痛、小兒疳積證，以及西醫(yī)的慢性胃腸炎、胃腸潰瘍、慢性支氣管炎、支氣管哮喘等疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)，脾氣虛證患者存在明顯胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙。臨

2、床工作中還發(fā)現(xiàn)，針刺足三里、天樞穴可有效治療脾氣虛證，但詳細(xì)的機(jī)理還不完全清楚。
　　目的:以苦寒泄瀉、耗氣破氣法致脾氣虛證大鼠模型為研究對(duì)象，觀察脾氣虛證大鼠小腸膽堿能神經(jīng)和平滑肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)損傷和針刺足三里、天樞穴治療后的變化。探討脾氣虛證致胃腸運(yùn)動(dòng)障礙的本質(zhì)和針刺足三里、天樞穴治療脾氣虛證的機(jī)理。
　　方法:60只健康成年Wistar大鼠，雌雄各半，體重200～250g，隨機(jī)分為對(duì)照組（10只）、SDSQ組（10只）、

3、自然恢復(fù)組（10只）、針刺足三里穴治療組（足三里組）（10只）、針刺天樞穴治療組（天樞組）（10只）、針刺足三里和天樞穴治療組（足三里和天樞組）（10只）。對(duì)照組每只大鼠灌服4ml蒸餾水，飲食不限，飼養(yǎng)30天;SDSQ組、足三里治療組、天樞治療組、足三里和天樞治療組和自然恢復(fù)組每只大鼠給予方①和方②交替灌胃[①:大黃、厚樸、枳實(shí)按(2∶1∶1)制成200％濃度煎劑;②:廣豆根、旋覆花、檳榔(3∶1∶1)制成200％濃度煎劑]，造模前20

4、天，3次/天，后15天，4次/天，每次4ml。造模成功后，各治療組分別給予①電針足三里穴;②電針天樞穴;③同時(shí)電針足三里穴+天樞穴（華佗牌HANS-200E型針刺治療儀以0.1mA初始電流刺激逐漸增強(qiáng)至0.4mA，每日晨7時(shí)至10時(shí)），治療2周;自然恢復(fù)組，造模成功后常規(guī)飼養(yǎng)4周。
　　取各組存活大鼠近幽門環(huán)處10cm的上段小腸，制作腸平滑肌肌層的全厚組織標(biāo)本。①HE染色:將標(biāo)本行石蠟包埋、切片，行HE染色，顯微鏡下觀察小腸組織的

5、形態(tài)學(xué)改變;②免疫熒光染色:用囊泡狀乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體(VAChT)抗體進(jìn)行小腸膽堿能神經(jīng)纖維的單標(biāo)記熒光染色;用PGP9.5抗體和α-actin抗體進(jìn)行小腸平滑肌細(xì)胞的雙標(biāo)記熒光染色。應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)、分析圖像，觀察各組大鼠小腸神經(jīng)和平滑肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)結(jié)構(gòu);③Tunel凋亡檢測(cè)法:利用Tunel凋亡檢測(cè)法觀察和分析各組大鼠小腸平滑肌細(xì)胞的凋亡數(shù)量。
　　結(jié)果:
　　1.大體標(biāo)本與對(duì)照組相比，SDSQ組大鼠胃腸極度

6、擴(kuò)張，具有明顯的胃腸道阻塞的癥狀;恢復(fù)組較SDSQ組胃腸擴(kuò)張稍緩解，胃腸梗阻征象明顯;足三里治療組胃腸擴(kuò)張、梗阻征象較SDSQ組和恢復(fù)組明顯減輕;天樞治療組胃腸擴(kuò)張、梗阻征象較SDSQ組和恢復(fù)組明顯減輕;足三里和天樞治療組胃腸擴(kuò)張、梗阻征象較SDSQ組和恢復(fù)組、天樞組、足三里組明顯減輕。
　　2.HE染色對(duì)照組:小腸粘膜完整無缺損、無破裂，腸絨毛完整，腸腺結(jié)構(gòu)清晰，肌層細(xì)胞分布均勻。SDSQ組:小腸粘膜多處缺損或破裂，上皮細(xì)胞有脫

7、落跡象，肌層組織結(jié)構(gòu)欠清晰，絨毛出現(xiàn)水腫?；謴?fù)組:小腸粘膜偶爾破裂，肌層組織結(jié)構(gòu)尚清晰，小腸絨毛水腫仍較明顯，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腸腺輕度充血。足三里組:小腸粘膜偶有破裂，上皮細(xì)胞分布均勻，肌層組織結(jié)構(gòu)較清晰，絨毛輕度水腫。天樞組:小腸粘膜鮮有破裂，肌層組織結(jié)構(gòu)清晰，絨毛水腫不明顯。足三里和天樞組:小腸粘膜基本完整，上皮細(xì)胞均勻分布，肌層組織結(jié)構(gòu)清晰，絨毛水腫較病理組明顯減輕，排列較整齊，未見明顯縮短、脫落，細(xì)胞核數(shù)量有所減少，炎性細(xì)

8、胞浸潤(rùn)極少，部分腸腺可見有輕度充血。
　　3.共聚焦顯微鏡檢測(cè)免疫熒光①腸神經(jīng):與對(duì)照組相比，SDSQ組大鼠小腸乙酰膽堿（cholinergic nerves，Ach）神經(jīng)纖維數(shù)目和積分光密度(integraloptical density，IOD)值明顯減少（P＜0.01），腸神經(jīng)數(shù)量明顯減少，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)紊亂且遭到明顯的破壞，相互之間連接明顯減少?；謴?fù)組大鼠小腸Ach神經(jīng)纖維數(shù)目較SDSQ組有所增加(P＜0.01)，熒光IOD

9、值有所恢復(fù)(P＜0.01)，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)紊亂，彼此連接減少，完整的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)受到破壞。足三里治療組和天樞治療組大鼠小腸Ach神經(jīng)纖維數(shù)目較恢復(fù)組明顯增多(P＜0.01)，神經(jīng)的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)得到基本維持，在細(xì)胞的熒光IOD值也明顯增加，顯著高于恢復(fù)組。(P＜0.01)。足三里和天樞治療組大鼠小腸神經(jīng)和Ach神經(jīng)纖維數(shù)目較恢復(fù)組明顯增多(P＜0.01)，較足三里、天樞單一治療組，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)更加清晰、完整，細(xì)胞的IOD值比恢復(fù)組明顯增加（P

10、＜0.01）。②小腸平滑肌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu):與對(duì)照組相比，SDSQ組大鼠小腸平滑肌細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，小腸神經(jīng)的IOD值明顯降低(P＜0.01)，神經(jīng)和平滑肌之間連接疏松、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞;恢復(fù)組大鼠小腸神經(jīng)數(shù)量較SDSQ組稍有增多，小腸平滑肌數(shù)量也略有增多，但不明顯。小腸神經(jīng)與平滑肌之間連接較致密，局部偶爾可見完整的神經(jīng)-平滑肌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，小腸神經(jīng)IOD值明顯增加(P＜0.01)。足三里治療組與恢復(fù)組相比，其小腸神經(jīng)及平滑肌數(shù)量有所增加，小

11、腸神經(jīng)和平滑肌間的連接較緊密，網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)比較清晰，小腸神經(jīng)的IOD值明顯增加（P＜0.01）。天樞治療組與恢復(fù)組比較，小腸神經(jīng)及平滑肌的數(shù)量有所增加，二者之間的相互連接也更加緊密，小腸神經(jīng)-平滑肌網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)較清晰，小腸神經(jīng)IOD值明顯增加(P＜0.01)。與足三里治療組相比，小腸神經(jīng)和平滑肌數(shù)量略有增加但不明顯，神經(jīng)與平滑肌之間的連接緊密程度、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的損傷程度及IOD值未見明顯差異。足三里和天樞治療組與恢復(fù)組相比，小腸神經(jīng)和平滑肌細(xì)胞

12、數(shù)量明顯增加，二者之間的連接緊密，可見清晰的神經(jīng)，平滑肌網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，IOD值明顯增加(P＜0.01)。與足三里、天樞單一因素治療組相比，其小腸神經(jīng)和平滑肌的數(shù)量明顯增加，小腸神經(jīng)與平滑肌的相互連接緊密，二者構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)清晰可見，IOD值明顯增加(P＜0.01)。③平滑肌細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù):與對(duì)照組相比，SDSQ組大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多(P＜0.01)，完整的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)消失。恢復(fù)組大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)量較SDSQ組明顯減少（P＜0.01），但較各

13、治療組仍較多(P＜0.01)。足三里治療組大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)量比恢復(fù)組明顯減少(P＜0.01);天樞治療組大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)量比恢復(fù)組明顯減少(P＜0.01)。足三里治療組和天樞穴治療組較足三里治療組無顯著差異（P＞0.01）。足三里和天樞治療組大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)量比恢復(fù)組明顯減少(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.苦寒泄瀉、耗氣破氣所致SDSQ組大鼠胃腸極度擴(kuò)張，具有明顯的胃腸道阻塞的癥狀;針刺足三里治療和針刺天樞的治療能緩解其胃

14、腸梗阻癥狀，但效果較差;針刺足三里和天樞穴治療能夠有效、明顯地改善胃腸麻痹梗阻征象。
　　2.SDSQ狀態(tài)下，小腸組織受到明顯的損傷，正常的生理結(jié)構(gòu)遭到破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而這些病理改變必然導(dǎo)致腸道功能的障礙，通過針刺足三里和天樞穴治療能有效修復(fù)小腸組織的損傷，抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，從而起到保護(hù)小腸組織正常結(jié)構(gòu)，促進(jìn)胃腸動(dòng)力恢復(fù)的作用。
　　3.SDSQ胃腸動(dòng)力障礙的發(fā)生與小腸神經(jīng)的損傷、神經(jīng)-平滑肌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞和平滑肌細(xì)