陽明腑實(shí)證大鼠小腸神經(jīng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)的損傷和下法施治機(jī)制研究.pdf

1、背景：陽明腑實(shí)證是指無形燥熱彌漫在經(jīng),充斥于表里內(nèi)外,劫傷津液,腸中并無燥屎阻結(jié)的熱證;亦包括熱邪與宿食糟粕相搏結(jié),津液被耗,形成有形的實(shí)邪壅滯在大腸致燥屎內(nèi)結(jié)的腑實(shí)證。陽明腑實(shí)證患者有明顯胃腸運(yùn)動(dòng)障礙的表現(xiàn)。下法代表中藥方劑大承氣湯可有效地治療陽明腑實(shí)證。近些年來的研究表明腸神經(jīng)和Caial間質(zhì)細(xì)胞(interstitiacells of Cajal,ICC)以及平滑肌細(xì)胞間形成網(wǎng)絡(luò)狀連接(胃腸道神經(jīng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò))。胃腸道神經(jīng)

2、-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)與胃腸運(yùn)動(dòng)功能密切相關(guān)。
　　 目的：通過觀察陽明腑實(shí)證大鼠小腸組織中腸神經(jīng).ICC之間形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的變化和小腸全厚肌層組織中ICC-平滑肌之間縫隙連接和ICC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變,探討陽明腑實(shí)證大鼠胃腸動(dòng)力功能障礙時(shí)腸神經(jīng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和細(xì)胞通訊傳導(dǎo)障礙機(jī)制以及大承氣湯的施治機(jī)制。
　　 方法：健康成年Wistar大鼠100只,隨機(jī)分為:對(duì)照組(20只)、陽明腑實(shí)證模型組(40只)

3、和大承氣湯治療組(40只)。對(duì)照組動(dòng)物腹腔注射1.0ml生理鹽水。陽明腑實(shí)證模型組服熱性中藥、自身糞便灌胃,然后腹腔注射1.0ml E.coloi.混懸液建立陽明腑實(shí)證模型。治療組于造模成功后即給予大承氣湯灌胃,2次/日,每次1.0ml/100g,連用5日。取各組存活大鼠上段小腸組織制作小腸全厚肌層組織標(biāo)本,進(jìn)行c-Kit和乙酰膽堿能神經(jīng)(vesicular acetylcholine transporter,VAChT),氮能神經(jīng)(n

4、euronal nitric oxide synthase,nNOS),肽能神經(jīng)(substance P,SP)和VIP神經(jīng)(vasoactive intestinal peptide,VIP)免疫熒光雙標(biāo)記染色后,激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)腸神經(jīng)-ICC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的變化;免疫組化染色分析ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá),透射電鏡觀測(cè)ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)和ICC超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 結(jié)果：對(duì)照組:胃腸形態(tài)正常,腸管顏色呈

5、粉紅色,漿膜光澤鮮亮,腸管之間無粘連,胃腸蠕動(dòng)頻率和形態(tài)正常。陽明腑實(shí)證模型組:胃腸極度擴(kuò)張,胃內(nèi)有大量氣體和內(nèi)容物滯留,腸腔內(nèi)大量液體潴留,多為糞水樣液體。大部分腸管肌層呈灰白色,肥厚,漿膜充血腫脹,偶可見黑色,散在的缺血表現(xiàn)。小腸系膜水腫肥厚,系膜根部淋巴結(jié)腫大。大網(wǎng)膜充血肥厚,有散出血斑點(diǎn),腹腔內(nèi)少量淡黃色清亮滲出液,部分出現(xiàn)血性腹水,壁層腹膜充血,肥厚,腹腔有明顯感染現(xiàn)象。胃腸蠕動(dòng)頻率減少,存在明顯腸道運(yùn)動(dòng)功能減弱征象。治療組:

6、胃腸道擴(kuò)張不明顯,胃腸腔內(nèi)潴留物較少或胃內(nèi)無物滯留。小腸漿膜壁紅潤(rùn),輕度肥厚,無充血,小腸壁和系膜水腫較輕,腹腔內(nèi)未見血性腹水,腹腔無污染。腸道蠕動(dòng)頻率較模型組明顯增加。
　　 共聚焦顯微鏡檢測(cè)腸神經(jīng)-ICC網(wǎng)絡(luò)的變化。對(duì)照組:小腸ICC相互連接形成較完整的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)。小腸膽堿能神經(jīng)(VACHT)/氮能神經(jīng)(NO)/肽能神經(jīng)(SP)/VIP神經(jīng)各自彼此相接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)含有成串的神經(jīng)節(jié)。ICC網(wǎng)絡(luò)圍繞著膽堿能神經(jīng)/氮能神

7、經(jīng)/肽能(SP)神經(jīng)/VIP神經(jīng)形成網(wǎng)絡(luò),腸神經(jīng)-ICC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)完整。
　　 模型組較對(duì)照組小腸ICC數(shù)量明顯減少(p＜0.01),細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯減弱,彼此之間的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)不完整。與對(duì)照組比較,小腸膽堿能神經(jīng)(VACHT)/氮能神經(jīng)神經(jīng)(NO)/肽能神經(jīng)(SP)/VIP神經(jīng)纖維數(shù)目明顯減少(p＜0.01),彼此間的連接減少,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)紊亂;神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的熒光強(qiáng)度減弱(p＜0.01),ICC與腸神經(jīng)纖維間的連接松散或消失,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

8、不完整,腸神經(jīng)-ICC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭受明顯破壞。
　　 治療組較模型組小腸ICC數(shù)量明顯增多(p＜0.01),網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)的完整性有所恢復(fù)。與模型組比較,ICC細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(p＜0.01)。治療組小腸膽堿能神經(jīng)(VACHT)/氮能神經(jīng)神經(jīng)(NO)/肽能神經(jīng)(SP)/VIP神經(jīng)神經(jīng)纖維數(shù)目明顯增加(p＜0.01)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn),彼此間的網(wǎng)絡(luò)連接的完整性恢復(fù)明顯,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的熒光強(qiáng)度增加(p＜0.01)。ICC與腸神經(jīng)纖維間的連

9、接接近正常,ICC-腸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)恢復(fù)明顯。
　　 免疫組化觀察分析連接蛋白Cx43對(duì)照組的小腸縱肌層大部分細(xì)胞存在呈陽性表達(dá)的Cx43蛋白,環(huán)肌層有少數(shù)細(xì)胞呈弱陽性表達(dá),肌間神經(jīng)叢處大部分細(xì)胞呈陽性表達(dá)。模型組小腸肌層Cx43蛋白陽性灰度較對(duì)照組減弱(p＜0.01),尤其以縱肌層明顯。治療組與模型組比較,Cx43蛋白陽性灰度增強(qiáng)(p＜0.01),尤其以縱肌層明顯。
　　 透射電鏡觀察對(duì)照組大鼠ICC特征:①胞質(zhì)和突起內(nèi)

10、含豐富的線粒體、可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)育良好的高爾基體;②有膜內(nèi)陷空泡;③有較多中間絲,無粗肌絲;④非常接近三級(jí)神經(jīng)束;⑤ICC相互之間、與平滑肌細(xì)胞間可見縫隙連接(gapjunctions);神經(jīng)纖維末梢與平滑肌細(xì)胞見緊密連接,間距約為100nm左右,形成完整的神經(jīng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。模型組大鼠ICC細(xì)胞突起明顯減少或消失,大量神經(jīng)纖維末梢腫脹,伴隨神經(jīng)遞質(zhì)小泡減少或消失;平滑肌細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,高爾基體腫脹,出現(xiàn)大量細(xì)胞膜內(nèi)陷

11、空泡,相互間的縫隙連接缺失;ICC與神經(jīng)纖維間的突觸樣連接缺如,間距增加:ICC相互間及其與平滑肌細(xì)胞間縫隙連接消失,存在較大間隙,神經(jīng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)受到明顯損傷。治療組大鼠部分ICC細(xì)胞突起損傷不明顯;神經(jīng)組織末梢較為豐富,少量神經(jīng)纖維末梢腫脹,神經(jīng)遞質(zhì)小泡無明顯減少;平滑肌細(xì)胞損傷不明顯,有少量細(xì)胞膜內(nèi)陷空泡;ICC與神經(jīng)纖維間保持突觸樣連接;ICC相互間及ICC與平滑肌細(xì)胞間存在縫隙連接,無明顯間隙;組織間隙內(nèi)存在

12、少量液性物質(zhì),神經(jīng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)形態(tài)基本保持完整。
　　 結(jié)論：陽明腑實(shí)證大鼠胃腸擴(kuò)張,胃腸功能紊亂征象明顯;大承氣湯能夠顯著改善胃腸運(yùn)動(dòng)功能功能。
　　 陽明腑實(shí)證時(shí),小腸膽堿能神經(jīng)(VACHT)/氮能神經(jīng)(NO)/肽能神經(jīng)(SP)/VIP神經(jīng)數(shù)目減少;神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞,ICC數(shù)量減少,ICC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞,腸神經(jīng)-ICC之間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞。由于小腸上行興奮性神經(jīng)和下行的抑制性神經(jīng)形態(tài)學(xué)改變以及他們之間的網(wǎng)絡(luò)

13、破壞,導(dǎo)致神經(jīng)之間的傳導(dǎo)功能改變。這可能是陽明腑實(shí)證大鼠小腸胃腸動(dòng)力功能障礙的細(xì)胞形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。大承氣湯可能通過抑制炎癥,抗菌、抑制內(nèi)毒素吸收,以及穩(wěn)定細(xì)胞膜等功能增加陽明腑實(shí)證大鼠小腸腸神經(jīng)和ICC的細(xì)胞數(shù)量,維持腸神經(jīng)-ICC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整。進(jìn)而恢復(fù)小腸運(yùn)動(dòng)功能。
　　 陽明腑實(shí)證時(shí),大鼠小腸肌層ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)縫隙連接蛋白Cx43陽性表達(dá)減少,細(xì)胞通訊功能蛋白減少。是陽明腑實(shí)證大鼠胃腸動(dòng)力功能改變的細(xì)胞學(xué)病理基礎(chǔ)。ICC-

14、平滑肌細(xì)胞之間縫隙連接消失或間隙增加,導(dǎo)致腸神經(jīng)-ICC-平滑肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的信號(hào)傳導(dǎo)通路破壞。大承氣湯治療后,大鼠小腸肌層ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)縫隙連接蛋白Cx43陽性表達(dá)增多,ICC-平滑肌細(xì)胞之間縫隙連接間隙接近正常,小腸肌層ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞間通訊傳導(dǎo)通路恢復(fù)。
　　 以上結(jié)果提示,陽明腑實(shí)證大鼠小腸腸神經(jīng)-ICC-平滑肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)改變是胃腸道動(dòng)力障礙的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ),大承氣湯能夠減輕腸神經(jīng)-ICC-平滑肌三者間結(jié)構(gòu)的損傷,維