結(jié)腸平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立及東北鶴虱松弛腸平滑肌作用初探.pdf

1、目的：建立離體大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞分離、純化、原代培養(yǎng)及鑒定的方法，在細(xì)胞水平研究東北鶴虱藥物血清的平滑肌松弛作用機(jī)制。 方法：1.采用混合酶法即胰蛋白酶消化雜細(xì)胞，膠原酶Ⅱ消化平滑肌細(xì)胞，分次消化、分次收集細(xì)胞，配合機(jī)械法吹打、過細(xì)胞篩得到細(xì)胞懸液，用含10％胎牛血清的DMEM液培養(yǎng)細(xì)胞，通過臺(tái)盼蘭染色法檢查細(xì)胞數(shù)量及存活率，差速貼壁法純化細(xì)胞，原代培養(yǎng)的細(xì)胞繪制生長曲線。2.新分離平滑肌組織常規(guī)甲醛固定、石蠟包埋、HE染色鑒定

2、組織純度，免疫組織化學(xué)ABC法用特異性平滑肌肌動(dòng)蛋白α-actin鑒定原代培養(yǎng)細(xì)胞。3.分別用東北鶴虱水提醇沉溶液5g/mL、10g/mL、15g/mL給大鼠灌胃，每天一次，連續(xù)7天，末次灌胃后2小時(shí)下腔靜脈取全血，離心后取上清液(含藥血清)，用MTT比色法測定含藥血清對結(jié)腸平滑肌細(xì)胞增殖的影響，通過細(xì)胞培養(yǎng)液的LDH檢測含藥血清的細(xì)胞毒性，測微尺測量給藥前后細(xì)胞長度，計(jì)算舒張百分?jǐn)?shù)，應(yīng)用Ca3+熒光指示劑Fura-2/AM測定結(jié)腸平滑

3、肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度。 結(jié)果：成功分離出大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞，存活率＞95％，新分離的細(xì)胞呈橢圓形或梭形，胞核位于中央。含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)36小時(shí)后細(xì)胞貼壁，細(xì)胞生長呈明顯的遲滯期(第0-3天)，對數(shù)期(第3-7天)和平臺(tái)期(第7-10天)，第十天左右融合成單層。平滑肌條病理切片鏡下見細(xì)胞呈紅色梭形，排列整齊，胞漿豐富，胞核呈紫藍(lán)色，雪茄煙狀。免疫組化見細(xì)胞呈梭形或多角形，胞漿內(nèi)棕色及淺棕色細(xì)顆粒，核呈淺藍(lán)色，為陽

4、性反應(yīng)，顯示培養(yǎng)的CSM細(xì)胞純度較高。含藥血清(10倍稀釋)作用于細(xì)胞后MTT測定顯示與空白對照組比較，低濃度LEG組對細(xì)胞有明顯的促進(jìn)增殖作用(P＜0.01)，而中、高濃度組與空白對照組無顯著性差異。細(xì)胞培養(yǎng)液的LDH檢測結(jié)果顯示低濃度組LDH明顯低于空白對照組(P＜0.01)，提示LEG對細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，而中、高濃度組LDH明顯高于空白對照組(P＜0.01)，提示過高濃度含藥血清會(huì)對細(xì)胞造成損傷或促進(jìn)凋亡。含藥血清(20倍稀釋)

5、作用于CSM細(xì)胞，與空白對照組比較，低、中、高濃度組細(xì)胞舒張百分?jǐn)?shù)分別為3.69％、8.38％、10.39％，LEG含藥血清對CSM細(xì)胞的松弛作用呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在胞外鈣離子正常存在條件下，Ach(10μmol/L)能使[Ca2+]i增加，升幅達(dá)108.5％，Ver(5μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞后，能顯著抑制Ach誘導(dǎo)的[Ca2+]i升高，降幅為41.4％，低、中、高濃度LEG含藥血清(100倍稀釋)預(yù)處理細(xì)胞，對Ach誘導(dǎo)的[C

6、a2+]i升高均有抑制作用，降幅分別為3.8％，5.4％，14.0％，但只有LEG-H有顯著性意義。細(xì)胞外鈣為零時(shí)，Ach(10μmol/L)能使[Ca2+]i增加，增幅達(dá)66.4％，10mmol/Lcaffeine(caf)能使[Ca2+]i升高，增幅達(dá)175.6％，procaine(pro)10mmol/L預(yù)處理細(xì)胞能顯著抑制caf誘導(dǎo)的[Ca2+]i升高，降幅為35.1％，低、中、高濃度LEG含藥血清(100倍稀釋)預(yù)處理細(xì)胞后，

7、對caf誘導(dǎo)[Ca2+]i升高均有降低作用，降幅分別為4.2％，14.6％，17.9％，以中、高劑量LEG含藥血清的作用非常顯著。Ach增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，既能增加外鈣內(nèi)流，又能促進(jìn)內(nèi)鈣釋放。Ver和高濃度組LEG含藥血清能抑制Ach增加[Ca2]i的作用，caf通過促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+經(jīng)肌質(zhì)網(wǎng)RyR通道釋放到胞漿而增加[Ca2+]i，pro、中劑量和高劑量組LEG含藥血清能拮抗caf增加[Ca2+]i的作用。 結(jié)論：應(yīng)用酶解法