S-烯丙基巰基半胱氨酸的代謝、抗慢阻肺機制及聯(lián)合用藥研究.pdf

1、大蒜(Allium Sativum)可用于各種疾病的預(yù)防和治療，具有抑制致癌物活化、解毒、抗氧化和保護DNA損傷等功效。然而鮮大蒜的刺激性和難聞的氣味限制了其藥用價值，后來大蒜經(jīng)高溫發(fā)酵制得了老蒜(Aged Garlic)，與普通生蒜相比老蒜更加安全，且可以顯著降低鮮蒜的刺激性。研究發(fā)現(xiàn)老蒜主要含有的含硫化合物包括S-烯丙基半胱氨酸(SAC)、S-烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)和蒜氨酸(SACS)，其中SAMC藥理活性較高。SAMC在抗

2、癌、保肝和抗慢阻肺等方面均具有顯著的藥理活性。目前有關(guān)SAMC的研究大多局限于抗癌活性的評價，而對其合成、代謝、抗慢阻肺機制及聯(lián)合用藥鮮有報道。因此本課題從合成、代謝、活性機制及聯(lián)合用藥幾個方面對SAMC進行了初步研究。
　　本課題的內(nèi)容包括以下六個章節(jié):第一章，首先合成了SAMC，并對其理化性質(zhì)、穩(wěn)定性等進行了初步藥學(xué)評價;第二章和第三章，利用多種體外模型對SAMC的代謝機制進行了研究;第四章，針對SAMC的吸收、分布、代謝和排

3、泄等進行了體內(nèi)研究，并建立了SAMC及其代謝物體內(nèi)含量的測定方法;第五章，從信號通路、抗炎抗氧化及蛋白修飾的角度對SAMC抗慢阻肺的作用機制進行了研究;第六章，對其緩解抗真菌藥物泊沙康唑(POS)所致不良反應(yīng)的作用和機制進行了評價和分析。
　　SAMC的初步藥學(xué)評價（第一章）包括合成工藝、純度分析、結(jié)構(gòu)確證、理化性質(zhì)和穩(wěn)定性研究。SAMC在實體大蒜中的含量很低，提取工藝費時費力，且純化過程復(fù)雜低效。為了得到穩(wěn)定可靠的SAMC原料來

4、源，本課題對SAMC的合成工藝進行了充分的調(diào)研，對不同路線進行了綜合分析，最后采用兩步的合成工藝成功制備了高純度的SAMC原料。隨后，采用UV、IR、HRMS、1H-NMR以及13C-NMR對SAMC進行了結(jié)構(gòu)確證。并對SAMC的性狀、熔點、不同溶劑中的溶解度、油水分配系數(shù)、解離常數(shù)、穩(wěn)定性等進行了測定。結(jié)果顯示，SAMC為白色或類白色片狀物，熔點179.21℃（也為分解點），在水中可溶，在乙醇、丙酮、二氯甲烷等有機溶劑中幾乎不溶;其油

5、水分配系數(shù)logP小于0，屬于親水性化合物。其解離常數(shù)分別為2.7和9.1。在純度分析和穩(wěn)定性研究的過程中，我們建立了SAMC含量體外測定的液相色譜法，并對分析方法進行了驗證，實驗結(jié)果表明該色譜法專屬性和線性良好，準(zhǔn)確度和精密度等均滿足要求。穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，SAMC在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性較好，但在堿性環(huán)境中極不穩(wěn)定，極易降解;加速試驗結(jié)果顯示，SAMC在鋁塑包裝條件下可以室溫穩(wěn)定存放。
　　SAMC體外代謝機制研究（第二章）包括

6、肝細(xì)胞中代謝和肝微粒體中代謝兩個部分。首先建立了肝細(xì)胞和肝微粒體兩個體外代謝模型，并對不同模型所生成的代謝物進行了鑒定;同時考察了參與SAMC代謝的主要CYP450酶亞型及SAMC對CYP450的抑制作用;最后對其酶促動力學(xué)參數(shù)進行了測定。結(jié)果表明SAMC在肝細(xì)胞中有兩個代謝物，在肝微粒體中有四個代謝物。其最佳孵育時間及蛋白濃度分別為15 min和1 mg/mL。參與SAMC代謝的主要酶亞型為CYP3A4和CYP1A1，同時SAMC對C

7、YP2E1具有一定的抑制性。其酶促動力學(xué)結(jié)果表明Vmax和Km分別為24.29μM/min/mg肝微粒體和339.7μM。
　　SAMC體外代謝機制研究（第三章）主要研究了SAMC在血液中的代謝。首先對SAMC在血中的代謝產(chǎn)物進行了鑒定;其次對SAMC在血中的代謝位點進行了確定，同時研究了內(nèi)源性巰基化合物對SAMC的影響;隨后對SAMC的代謝機制及代謝動力學(xué)進行了研究;最后對SAMC的血漿蛋白結(jié)合及蛋白修飾進行了分析。結(jié)果表明，S

8、AMC在血中檢測到六個代謝產(chǎn)物，而其主要代謝蛋白為紅細(xì)胞中大于30 kD的蛋白。SAMC在紅細(xì)胞中代謝速率快、半衰期短，且一些含有巰基的內(nèi)源性物質(zhì)對SAMC的代謝具有較大的影響。蛋白結(jié)合及修飾結(jié)果表明，其血漿蛋白結(jié)合率約50％，同時SAMC可以使血紅蛋白93位和125位半胱氨酸殘基上游離的巰基發(fā)生烯丙基硫醇化，且多次注射給藥的大鼠體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了這種作用，但是相對強度較小。
　　SAMC體內(nèi)代謝研究（第四章）包括生物樣品分析方法的建立

9、和驗證、代謝產(chǎn)物鑒定、藥物代謝動力學(xué)、組織分布等研究內(nèi)容。本章節(jié)首先建立了SAMC體內(nèi)含量的LC-MS分析方法和其代謝產(chǎn)物的GC-MS分析方法并進行了驗證，同時對SAMC通過灌胃給藥后的代謝、分布與排泄進行了研究。結(jié)果表明所建立的LC-MS和GC-MS兩種方法專屬性好，精密度高、且準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等符合要求。灌胃給藥后，在體內(nèi)未檢測到SAMC原型藥物，而是檢測到它的兩個主要的代謝產(chǎn)物AMSO和AMSO2。其代謝產(chǎn)物AMSO的最高血藥濃度C

10、max為134.933±32.041μg/mL，而AMSO2最高血藥濃度Cmax為122.27±21.937μg/mL;AMSO與AMSO2的達峰時間分別為24 h和36 h;AMSO的半衰期在12小時左右，而AMSO2的半衰期高達26 h以上。組織分布研究表明，灌胃給藥后，SAMC的兩個代謝物在大鼠的心、肝、脾、肺和腎中均有分布。相對于心、脾、肺和腎等組織，兩個代謝物在肝組織中的濃度較高。排泄研究表明，SAMC的代謝產(chǎn)物可以通過尿液、

11、糞便及膽汁排泄。為進一步了解SAMC在體內(nèi)代謝的情況，采用尾靜脈注射給藥的方式，對其代謝動力學(xué)進行了研究。在給藥劑型的制備上，加入了吐溫-80，并通過高壓均質(zhì)機進行了處理，屬于微粒體分散體系，具有了一定的緩釋作用。測定結(jié)果表明，SAMC在體內(nèi)的半衰期極短，不足5 min。
　　SAMC用于治療慢阻肺的活性機制研究（第五章）由信號通路的探索、抗炎抗氧化保護機制以及藥物作用位點研究三個方面組成。(1)信號通路的研究是通過LPS誘導(dǎo)人體

12、肺腺癌細(xì)胞SPC-A1建立了COPD模型，從對粘膜蛋白MUC5AC的抑制作用和膜蛋白AQP-5的激活作用兩個方面評價SAMC對SPC-A1的保護作用。ELISA實驗結(jié)果表明，SAMC對LPS誘導(dǎo)SPC-A1中MUC5AC表達具有顯著抑制作用;而RT-PCR實驗結(jié)果從RNA水平進一步證明了SAMC對LPS誘導(dǎo)的MUC5AC的抑制性。免疫印跡和免疫熒光的實驗結(jié)果顯示，SAMC能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的SPC-A1中IκBα的降解及P65的核轉(zhuǎn)

13、移。綜合以上結(jié)果可以看出，SAMC可以通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路抑制SPC-A1中MUC5AC的分泌，以達到緩解COPD的作用。(2) SAMC抗炎抗氧化的活性研究是利用所構(gòu)建的巨噬細(xì)胞NR8383和SD大鼠炎癥和氧化損傷模型來完成的。實驗結(jié)果表明SAMC能夠顯著降低由LPS所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NR8383和大鼠肺灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-8的水平。而氧化應(yīng)激測定結(jié)果表明SAMC對于巨噬細(xì)胞中的ROS、SOD及MDA具有調(diào)節(jié)作用

14、。同時SAMC能夠降低LPS造成的大鼠肺濕重干重比率，抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠肺組織中MPO和NO水平的升高。病理切片以及免疫組化的觀察結(jié)果表明SAMC不僅可以抑制LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥，而且能夠修復(fù)損傷的大鼠肺組織。免疫組化結(jié)果還顯示SAMC抗炎作用可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB來實現(xiàn)的，該結(jié)果與體外細(xì)胞實驗一致。(3)蛋白修飾實驗結(jié)果表明，SAMC可誘導(dǎo)MUC5AC蛋白第5564號CYS發(fā)生S-半胱氨酸化，可通過掩蓋蛋白表面暴露的半胱氨酸殘基，

15、阻止蛋白之間二硫鍵的形成，進而改變粘蛋白的三級構(gòu)像，降低粘液的粘度，使得呼吸道的粘液易于咳出，從而緩解COPD所引起的氣道阻塞的癥狀。
　　SAMC和抗真菌藥物（泊沙康唑，POS）聯(lián)合用藥研究（第六章），包括SAMC對抗真菌藥物不良反應(yīng)的作用評價及機制研究。首先，通過噴霧干燥技術(shù)制備了POS腸溶微球，并對其進行了表征。其次，以昆明小鼠為模型，研究了SAMC對POS所致小鼠不良反應(yīng)的保護作用。研究結(jié)果表明，POS連續(xù)給藥一周(100

16、 mg/kg)小鼠出現(xiàn)飲食減少、懶動、倦怠、豎毛、毛無光澤，腹瀉發(fā)生率達40％;而同時給予SAMC與POS組，可使精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，腹瀉發(fā)生率降低到20％。抗炎機制研究結(jié)果表明，聯(lián)合治療組能夠顯著降低由POS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β及IL-6的表達水平?？寡趸瘷C制研究結(jié)果表明，聯(lián)合給藥低和高劑量組均能降低由POS誘導(dǎo)的MDA表達水平分別約20％和30％。組織病理切片結(jié)果顯示，聯(lián)合給藥組小鼠結(jié)腸組織相對比于POS組，炎性浸潤及粘膜粘連

17、均有一定的修復(fù)，且結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)更清晰可辨。以上結(jié)果說明SAMC可以從抗氧化抗炎方面緩解POS所致的不良反應(yīng)。
　　綜上所述，本課題首先對SAMC的合成工藝、結(jié)構(gòu)鑒定、理化性質(zhì)和穩(wěn)定性等進行了初步藥學(xué)評價。隨后從體內(nèi)、體外兩個方面對SAMC的代謝、組織分布和排泄進行了研究。接著從分子通路、抗炎抗氧化及蛋白修飾等方面對其抗慢阻肺機制進行了研究。最后對SAMC與POS聯(lián)合使用時降低抗真菌藥物不良反應(yīng)的機理進行了分析。結(jié)果表明，SAMC具