高效合成s-腺苷同型半胱氨酸的雙酶體系及其應(yīng)用的研究.pdf

1、S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）是一種氨基酸衍生物，在生物體內(nèi)與抗病性相關(guān)，是對(duì)相關(guān)病理障礙進(jìn)行早期診斷的重要指標(biāo)。外源SAH有鎮(zhèn)靜劑作用，是有效的安眠藥和抗驚厥藥物，同時(shí)也是一種抗病毒因子。隨著SAH在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛研究與應(yīng)用，其高效生產(chǎn)制備技術(shù)也成為近年國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)課題。
　　本文將來(lái)源于極端嗜熱菌屬海棲熱袍桿菌Thermotoga maritima MSB8編碼的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的結(jié)構(gòu)基因sahase和乳酸脫氫酶

2、的結(jié)構(gòu)基因ldh分別與新型熱激質(zhì)粒pHsh連接，得到重組質(zhì)粒pHsh-sahase，pHsh-ldh。將重組質(zhì)粒pHsh-sahase，pHsh-ldh分別轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL和BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，得到了極耐熱性S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)和極耐熱性乳酸脫氫酶(LDH)。對(duì)重組菌(pHsh-sahase)產(chǎn)生的重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)熱處理、Ni離子親和

3、柱層析兩步純化得到電泳純級(jí)的蛋白，并對(duì)純酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。對(duì)重組菌(pHsh-ldh)產(chǎn)生的重組乳酸脫氫酶進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)熱處理、DEAE-Sepharose FF陰離子柱兩步純化得到電泳純級(jí)的蛋白，并對(duì)純酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。
　　對(duì)Tm-SAHase的酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該酶是一種NAD依賴型酶，在反應(yīng)過(guò)程中需要要消耗大量NAD。在1mMNAD下，該酶的最適反應(yīng)溫度為85℃，最適反應(yīng)pH為8.5，90℃酶活半衰期為1.5

4、h。在8mM NAD下，該酶的最適反應(yīng)溫度高于100℃，最適pH為11.2。在工業(yè)生產(chǎn)常用溫度60℃下，該酶能夠長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定，并具有較高的酶活力。SDS-PAGE結(jié)果顯示該重組酶的分子量為45kD，與理論值相符。
　　對(duì)Tm-LDH的酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該酶的最適反應(yīng)溫度為95℃，最適pH7.0;純酶在90℃的半衰期為2h，在pH5.5～8.0之間最穩(wěn)定;SDS-PAGE結(jié)果顯示分子量為33 kD，與理論推算值相吻合。以丙酮酸和N

5、ADH為底物時(shí)，相對(duì)于丙酮酸的Km值1.7 mmo l/L，Vmax為3.8×104 U/mg;相對(duì)于NADH的Km值7.2mmol/L，Vmax值為1.1×105 U/mg。Tm-LDH基因在T7載體中未能實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，但是在熱激載體pHsh中得到了可溶性超量表達(dá)，表達(dá)水平達(dá)到340 mg/L。該酶在65℃反應(yīng)條件下，活性達(dá)到最高活性的50％，并能保持活性不變，這使該酶能夠與常溫酶匹配，在輔酶NAD再生體系的建立中具有廣泛的用途。

6、r>　　本研究首次采用重組極耐熱性Tm-SAHase進(jìn)行SAH的酶法生產(chǎn)，在最適的生產(chǎn)條件下，0.5mg的Tm-SAHase可催化合成24μmol SAH。為了減少SAH生產(chǎn)過(guò)程中輔酶NAD的需求量，同時(shí)使Tm-SAHase維持較高的酶活性和穩(wěn)定性，我們使用海棲熱袍菌來(lái)源的重組極耐熱性LDH與Tm-SAHase配伍，構(gòu)建輔酶NAD再生系統(tǒng)，使SAH的產(chǎn)量在相同生產(chǎn)條件下較單酶系統(tǒng)提高了6倍。因此，海棲熱袍菌來(lái)源的極耐熱性SAHase和L