大白菜半胱氨酸脫巰基酶突變植株的構(gòu)建.pdf

1、硫化氫(Hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化氮和一氧化碳之后第三種氣體信號(hào)分子，在植物體的生長(zhǎng)發(fā)育和抵御外界脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)，環(huán)境污染日益嚴(yán)重，對(duì)大白菜的生長(zhǎng)發(fā)育過程產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制作用。半胱氨酸脫巰基酶(DES1和LCD)是產(chǎn)生H2S的關(guān)鍵酶，將DES1和LCD基因整合入大白菜基因組，有可能提高其抗逆性，同時(shí)為白菜育種提供新種質(zhì)。另外，CRISPR/Cas9被認(rèn)為是第三代基因組編輯技術(shù)，具有較高的基因編

2、輯效率，利用CRISPR/Cas9技術(shù)將白菜中半胱氨酸脫巰基酶基因功能敲除，可為研究H2S信號(hào)在大白菜中的生理功能提供理論基礎(chǔ)以及為后續(xù)研究提供突變體材料。
　　本實(shí)驗(yàn)以大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensi)自交系“矮青1號(hào)”為材料，在本課題組已有的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體系基礎(chǔ)上對(duì)種子的消毒時(shí)間、菌液侵染時(shí)間以及抗生素篩選壓進(jìn)行優(yōu)化，獲得有效的轉(zhuǎn)化體系，同時(shí)構(gòu)建了DES1、LCD過表達(dá)載體和LCD缺失

3、突變載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法成功獲得了遺傳轉(zhuǎn)化植株，本文主要研究結(jié)果如下:
　　1.過表達(dá)載體的構(gòu)建:用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ-HF和EcoRⅠ-HF雙酶切載體pET-28a-DES1和XF-246，BamHⅠ-HF和SalⅠ-HF雙酶切載體pET-28a-LCD和pCAM2300，將具有相同粘末端的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到過表達(dá)載體XF-246-DES1和pCAM2300-LCD，通過酶切和PCR鑒定

4、證明重組載體構(gòu)建成功，并成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404。
　　2.缺失突變載體的構(gòu)建:爭(zhēng)對(duì)大白菜LCD基因設(shè)計(jì)了20bp靶點(diǎn)，化學(xué)合成該序列，并將其克隆到中間線性載體AtU6-26-sgRNA-SK中，酶切和測(cè)序鑒定正確。然后用NheⅠ-HF和SpeⅠ-HF雙酶切重組載體AtU6-26-sgRNA-SK-LCD，得到sgRNA cassette片段，同時(shí)用SpeⅠ-HF單酶切載體pYAO，將基因片段與線性載體片段回收連接后轉(zhuǎn)化DH

5、5a，得到缺失突變載體pYAO-LCD，經(jīng)酶切鑒定正確，并成功轉(zhuǎn)化了農(nóng)桿菌LBA4404。
　　3.大白菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化:用0.1％的HgCl2對(duì)種子消毒6min，既能保持較高的萌發(fā)率又能防止內(nèi)源菌的產(chǎn)生;用OD600為0.2～0.3的菌液侵染外植體5min，分別以7.5mg·L-1和5.0mg·L-1的潮霉素作為抗性芽和根的抗生素篩選濃度，轉(zhuǎn)化效率較高，過表達(dá)載體XF246-DES1轉(zhuǎn)化大白菜的轉(zhuǎn)化率為10％;過表達(dá)載體pC

6、AM2300-LCD的轉(zhuǎn)化率為8％;CRISPR/Cas9敲除突變載體pYAO-LCD的轉(zhuǎn)化率為13.3％。
　　4.轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè):通過qRT-PCR檢測(cè)了陽(yáng)性植株中轉(zhuǎn)化目的基因的表達(dá)量以及利用四通道自由基分析儀測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植株中H2S含量，結(jié)果顯示:DES1和LCD過表達(dá)植株中DES1和LCD的表達(dá)量顯著提高，且H2S含量極顯著升高;LCD缺失突變植株(lcd)中，LCD靶點(diǎn)序列發(fā)生了堿基替換，說明CRISPR/Cas9基因