S-炔丙基半胱氨酸對于血管新生的作用及相關(guān)分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　血管新生，作為一種由預(yù)先存在的血管而萌生新血管的生理或病理過程，在缺血性心臟病的恢復(fù)過程中扮演著重要的角色。其中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通過與之受體VEGFR2結(jié)合可以激活下游信號通路發(fā)揮促進(jìn)血管新生的作用。信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，在血管新生中起著重要的調(diào)控作用，其在心臟中的缺失會(huì)嚴(yán)重阻礙缺血心臟的恢復(fù)。硫化氫作為一種氣體信號分子，已被證明具有顯著的促血管新生作用，特別是其在下肢

2、缺血大鼠模型中作用的闡明，為硫化氫介導(dǎo)的促血管新生治療提供了重要的理論依據(jù)。盡管如此，硫化氫作為氣體分子，本身仍不能作為藥物使用。所以基于此，課題組開發(fā)了內(nèi)源性硫化氫的調(diào)節(jié)劑S-炔丙基半胱氨酸(SPRC)，其可以通過直接作用于胱硫醚-γ-裂解酶(CTH)產(chǎn)生內(nèi)源性硫化氫，從而使得硫化氫用于藥物治療成為可能。在前期實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)SPRC對于缺血心臟具有顯著的心臟保護(hù)作用，那么作為內(nèi)源性硫化氫的調(diào)節(jié)劑，在本文主要研究了SPRC可能存在的促血管

3、新生作用，以及在這一過程中重要轉(zhuǎn)錄因子STAT3可能介導(dǎo)的分子機(jī)制。
　　方法：
　　首先使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，通過MTT實(shí)驗(yàn)、EdU摻入實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)、劃痕損傷實(shí)驗(yàn)、transwell遷移實(shí)驗(yàn)以及Matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn)評估了血管新生中的增殖、黏附、遷移及管腔形成四大指標(biāo)，檢測SPRC對體外血管新生的影響。通過大鼠動(dòng)脈環(huán)模型、Matrigel栓模型、海綿植入模型、燙傷模型以及雞胚絨毛尿囊膜模型檢測了SPRC對體內(nèi)正

4、常狀態(tài)下血管新生的影響。其中重點(diǎn)研究了Matrigel栓模型，通過HE染色、CD31免疫組化染色以及血紅蛋白含量測定分析了血管密度及血流量。最后，建立了兩個(gè)缺血模型，包括小鼠下肢缺血模型及大鼠心梗模型，檢測了SPRC對體內(nèi)缺血狀態(tài)下血管新生的影響。在下肢缺血模型中，通過多普勒血流灌注成像分析了血流變化，通過血管造影分析了側(cè)支循環(huán)的血管密度，通過CD31免疫組化染色分析了毛細(xì)血管的密度。在心梗模型中，通過心臟超聲、TTC染色、Masson

5、染色分析了心功能、梗死面積、纖維化面積等各項(xiàng)心臟指標(biāo)，通過血管造影分析了側(cè)支循環(huán)的血管密度。
　　在機(jī)制研究中，首先通過Western檢測了STAT3、MAPK家族以及Akt等蛋白在SPRC作用之后磷酸化水平的變化。使用STAT3 siRNA干擾內(nèi)皮細(xì)胞中STAT3的表達(dá)再檢測體外血管新生的各項(xiàng)指標(biāo)，以證明STAT3在SPRC促血管新生中的關(guān)鍵作用。通過SPRC與STAT3共結(jié)晶檢測兩者是否存在直接的相互作用。通過免疫共沉淀檢測V

6、EGFR2/Grb2、VEGFR2/STAT3以及VEGFR2/JAK之間的相互作用。同時(shí)，使用VEGFR2磷酸化抑制劑SU5416或VEGFR2 siRNA作用內(nèi)皮細(xì)胞，再分析STAT3磷酸化水平，以證明信號傳導(dǎo)的方向。最后，分離胞核和胞漿蛋白Western檢測或confocal直接定位，分析STAT3向核轉(zhuǎn)移情況。通過EMSA分析核內(nèi)STAT3活力，通過ChIP分析STAT3與特定基因啟動(dòng)子的結(jié)合情況，并且通過Western分析了基

7、因轉(zhuǎn)錄后的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　在體外實(shí)驗(yàn)中，SPRC可以促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的活力、增殖、黏附、遷移以及管腔形成。在正常狀態(tài)下的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，SPRC可以促進(jìn)大鼠動(dòng)脈環(huán)中細(xì)胞的向外遷出，促進(jìn)Matrigel栓中的血管生成，促進(jìn)血管向植入海綿中的延伸，促進(jìn)燙傷的愈合以及促進(jìn)雞胚絨毛尿囊膜上的血管新生。在缺血狀態(tài)下的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，SPRC可以在小鼠下肢缺血模型中促進(jìn)血流恢復(fù)、側(cè)支循環(huán)生成以及毛細(xì)血管密度增加;在大鼠心梗模

8、型中促進(jìn)心功能恢復(fù)、梗死面積及纖維化面積減少以及側(cè)支循環(huán)增加。
　　SPRC可以顯著促進(jìn)STAT3磷酸化，內(nèi)皮細(xì)胞敲除STAT3之后，SPRC促血管新生作用被抑制甚至消失，證明STAT3在介導(dǎo)這一過程中的關(guān)鍵作用。除此以外，SPRC亦促進(jìn)Erk、JNK及Akt的磷酸化，但抑制p38磷酸化。共結(jié)晶的結(jié)果顯示在加入SPRC前后，STAT3蛋白的半胱氨酸殘基電子云密度沒有額外的改變，排除了SPRC與STAT3直接作用的可能。免疫共沉淀顯

9、示SPRC給藥后，STAT3與VEGFR2的作用加強(qiáng)，伴隨著與Grb2的作用減少，暗示著STAT3向VEGFR2結(jié)合位點(diǎn)的聚集。而SU5416的加入或VEGFR2 siRNA的給予都會(huì)抑制SPRC誘導(dǎo)的STAT3磷酸化，證明信號由VEGFR2向STAT3傳遞。激活的STAT3可以看到向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)STAT3活力的增高。ChIP的分析顯示，SPRC引起STAT3與Vegf、 Akt、Erk及Cth啟動(dòng)子的結(jié)合增強(qiáng)，而通過Wes

10、tern的確檢測到了若干小時(shí)后VEGF及CTH蛋白合成的增加。
　　結(jié)論：
　　通過本文的工作，證明了SPRC作為一個(gè)內(nèi)源性硫化氫調(diào)節(jié)劑，可以有效地促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、黏附、遷移及管腔形成，同時(shí)在多種體內(nèi)模型中驗(yàn)證了SPRC在正常狀態(tài)及缺血狀態(tài)下的促血管新生作用，對于硫化氫介導(dǎo)的促血管新生治療具有重要的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，首次闡明了SPRC促血管新生中STAT3所介導(dǎo)的相關(guān)分子機(jī)制，包括H2S-VEGFR2-STAT3這