HSNGLPL多肽修飾聚氨酯的體內(nèi)反應(yīng)性研究.pdf

1、文章分為以下部分:
　　第一部分 分析HSNGLPL多肽修飾聚氨酯(HSNGLPL-PUs)的體外細(xì)胞相容性
　　目的:
　　通過(guò)分析材料浸提液對(duì)C2C12細(xì)胞增殖及毒性的影響，探討HSNGLPL-PUs的細(xì)胞相容性。
　　方法:
　　將合成的L-P-PU（50mg HSNGLPL修飾）、M-P-PU（100mg HSNGLPL修飾）及H-P-PU（150mg HSNGLPL修飾）按試樣表面積/浸泡液體積=

2、6cm2/mL比率提取浸提液(DMEM，48h)，并與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)48h，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。
　　結(jié)果:
　　RGR細(xì)胞毒性評(píng)定表明，聚氨酯浸提液具有一定的細(xì)胞毒性（1級(jí)），但50-100mg濃度范圍內(nèi)HSNGLPL多肽修飾并未改變聚氨酯的細(xì)胞活性。
　　結(jié)論:
　　HSNGLPL多肽成分的添加及處理過(guò)程不影響聚氨酯材料的細(xì)胞相容性。
　　第二部分 HSNGLPL-PUs材料的體內(nèi)炎癥和免

3、疫反應(yīng)性研究
　　目的:
　　分析植入肌內(nèi)材料誘導(dǎo)的肌內(nèi)炎性滲出及肌纖維的壞死和再生，明確HSNGLPL-PUs的體內(nèi)反應(yīng)性。
　　方法:
　　將HSNGLPL多肽液、BDO-PU（無(wú)HSNGLPL修飾）、L-P-PU、M-P-PU和H-P-PU材料(0.2×0.4cm2)植入腓腸肌內(nèi)，在14d、28d、42d和56d，摘取小鼠腓腸肌，冰凍切片、H&E染色或免疫熒光染色并觀察:i）單核/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)

4、胞(DCs)的滲出;ii）巨噬細(xì)胞凋亡;iii)植入物周邊肌纖維的壞死和再生、再生肌纖維MHC-Ⅰ表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　14d，BDO-PU炎性滲出最顯著，隨后逐漸消退，56d時(shí)炎癥基本消失;L-P-PU、M-P-PU和H-P-PU誘發(fā)的炎性滲出在移植初期(7-14d)時(shí)低于BDO-PU，但炎癥持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，56d仍可見(jiàn)滲出的淋巴細(xì)胞;在14d、28d和42d，BDO-PU肌內(nèi)巨噬細(xì)胞凋亡數(shù)顯著高于L-P-PU、M-P-PU

5、和H-P-PU組，但56d時(shí)L-P-PU、M-P-PU和H-P-PU組仍可見(jiàn)較多的凋亡細(xì)胞;BDO-PU組肌內(nèi)罕見(jiàn)DCs細(xì)胞(CD11c+)，但L-P-PU、M-P-PU和H-P-PU材料誘發(fā)更顯著的DCs滲出，滲出細(xì)胞的數(shù)量與PU材料內(nèi)的HSNGLPL多肽濃度呈正相關(guān);28d和42d時(shí)，各組材料周?chē)〗M織內(nèi)都可見(jiàn)CD3+/CD4+T細(xì)胞，56d時(shí)，BDO-PU材料周?chē)鶦D4+T細(xì)胞基本消失，L-P-PU、M-P-PU和H-P-PU組仍

6、觀察到CD4+T細(xì)胞;各組植入材料周?chē)梢?jiàn)肌纖維潰變，BDO-PU組于28d后可見(jiàn)新生肌纖維(Dystrophy+)，L-P-PU、M-P-PU和H-P-PU組則于植入早期(14d)出現(xiàn)肌纖維再生，HSNGLPL多肽濃度較高的H-P-PU組肌纖維的再生更為顯著，42d時(shí)該組材料周?chē)膿p傷肌纖維基本完成修復(fù)，BDO-PU材料于56d時(shí)仍可見(jiàn)中央核肌纖維;各組PU材料均不能誘發(fā)再生肌纖維表達(dá)MHC-Ⅰ分子。
　　結(jié)論:
　　H

7、SNGLPL-PUs肌內(nèi)植入后，將迅速誘發(fā)肌內(nèi)炎癥反應(yīng)及肌細(xì)胞壞死，滲出以單核-巨噬細(xì)胞為主。PU材料內(nèi)HSNGLPL肽成分可能抑制炎癥細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致炎癥的持續(xù)。此外，體內(nèi)的植入材料逐漸降解并釋放HSNGLPL肽成分，可能有助于局部肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖與分化，于移植后期促進(jìn)肌纖維再生。
　　第三部分 分析體內(nèi)、外條件下HSNGLPL-PUs對(duì)TGF-β的富集及釋放
　　目的:
　　明確合成的HSNGLPL-PUs

8、對(duì)TGF-β的富集及體內(nèi)釋放。
　　方法:
　　將各組HSNGLPL-PUs浸泡于含有500pg/mL的重組人TGF-β緩沖液中4℃1h，Elisa檢測(cè)緩沖液中殘余的TGF-β濃度;肌內(nèi)植入各組HSNGLPL-PUs材料，分別于14d和28d摘取肌組織，勻漿，Elisa檢測(cè)勻漿上清中TGF-β濃度。將預(yù)富集TGF-β的PU材料(HSNGLPL-PU-TGF-β)植入小鼠肌肉，分別于植入術(shù)后7，14，21，28d摘取肌肉，冰凍

9、切片，H&E及免疫熒光觀察炎癥滲出，masson染色觀察局部纖維化程度，或提取肌組織RNA，qRT-PCR觀察肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子水平改變。
　　結(jié)果:
　　體外條件下，HSNGLPL-PUs浸泡緩沖液中TGF-β水平顯著低于BDO-PU浸泡液，其降低程度與PU包含的HSNGLPL肽濃度呈正相關(guān)。14d時(shí)，包含H-P-PU材料的肌組織TGF-β濃度顯著高于HSNGLPL多肽注射組及BDO-PU組;28d時(shí)各組肌組織TGF

10、-β濃度無(wú)顯著差異。
　　較之BDO-PU和HSNGLPL-PU組，于移植7d和14d時(shí)，HSNGLPL-PU-TGF-β材料誘導(dǎo)更為劇烈的炎性滲出，但滲出范圍相對(duì)局限，持續(xù)時(shí)間較短，28d時(shí)炎癥基本消退。Masson染色可見(jiàn)，HSNGLPL-PU-TGF-β材料誘發(fā)的臨近肌組織纖維化（藍(lán)色）較其他材料組更加顯著。ER Stress標(biāo)志分子(ATF6、Bip、Calnexin、Spliced XBP1、CHOP和Cathepsin

11、 D)mRNA表達(dá)水平可見(jiàn)，材料各組顯著高于正常肌組織，隨種植時(shí)間延長(zhǎng)，上述分子水平逐漸下調(diào)。移植早期(7d)，HSNGLPL-PU-TGF-β組的ER Stress分子mRNA水平顯著高于BDO-PU和HSNGLPL-PU組。
　　結(jié)論:
　　體內(nèi)、外條件下，HSNGLPL多肽修飾的聚氨酯均可富集TGF-β分子。肌內(nèi)植入后，預(yù)富集的TGF-β自HSNGLPL多肽-聚氨酯材料快速釋放并可能干預(yù)肌內(nèi)炎性反應(yīng)和肌組織纖維化，并影