先天性巨結(jié)腸患者SEMA 3C-SEMA 3D基因突變?cè)谀c神經(jīng)系統(tǒng)中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景:先天性巨結(jié)腸(HSCR)是一種多基因改變導(dǎo)致的遺傳性先天性疾病，其基本病理特征為病變腸段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失伴神經(jīng)纖維排列紊亂，以致受累腸段持續(xù)異常收縮而近端結(jié)腸代償性擴(kuò)張，形成巨結(jié)腸?，F(xiàn)已明確HSCR是一種神經(jīng)嵴細(xì)胞源性疾病，多種因素均可影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育，其中軸突導(dǎo)向因子Semaphorin3(SEMA3)家族分子是一類表達(dá)于脊椎動(dòng)物的分泌型蛋白，主要通過調(diào)節(jié)突觸形成、軸突修剪、樹突棘的密度和成熟等來調(diào)控神經(jīng)元的遷移、增殖、分化甚

2、至凋亡。既往研究證實(shí)HSCR患者攜帶有SEMA3C/3D基因罕見突變，很可能參與HSCR發(fā)病。
　　目的:探索SEMA3C/3D突變蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)、遷移、分化和成熟的影響及其在分子水平的作用機(jī)制，進(jìn)一步闡明先天性巨結(jié)腸的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制。
　　方法:
　　1.分別用野生型(WT)和突變型(S329G SEMA3C、V337MSEMA3C、H424Q SEMA3C、V457I SEMA3D、P615T SEMA3D)

3、 SEMA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞獲取含融合蛋白的上清液，經(jīng)底物顯色法定量后，再用含0.5nm/ml相應(yīng)蛋白的野生型和突變型上清液分別處理Neuro-2a細(xì)胞1h，收集處理后的細(xì)胞先用免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞骨架的形態(tài)變化，再用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其遷移功能，同時(shí)提取處理后的細(xì)胞總蛋白用Western blot法檢測(cè)cofilin、ERM、CRMP2各蛋白表達(dá)水平及其重要位點(diǎn)磷酸化水平變化情況。
　　2.建立胎鼠腸神經(jīng)

4、嵴細(xì)胞(ENCC)原代培養(yǎng)的技術(shù)方法，用含0.5nm/ml相應(yīng)蛋白的野生型和突變型上清液分別處理細(xì)胞72h，再用含5％胎牛血清的促分化培養(yǎng)基孵育7d后，收集細(xì)胞先用特異性標(biāo)志物多重免疫熒光染色法檢測(cè)ENCC的分化傾向和神經(jīng)元成熟度，再用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其遷移能力。
　　結(jié)果:
　　1.與WT SEMA3D組相比，P615T SEMA3D作用下的Neuro-2a細(xì)胞的p-cofilin蛋白表達(dá)水平明顯降低，而其他

5、蛋白（cofilin、ERM、p-ERM、CRMP2、p-CRMP2）的表達(dá)水平均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與WT組相比，其他突變型SEMA3C/3D作用下的Neuro-2a細(xì)胞各蛋白表達(dá)水平也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.與空載對(duì)照組相比，WT SEMA3C/3D作用下的Neuro-2a細(xì)胞有收縮的趨勢(shì)，但軸突和樹突/樹突棘排列整齊、結(jié)構(gòu)完整;而突變型SEMA3C/3D作用下的Neuro-2a細(xì)胞明顯收縮，軸突和樹突/樹突棘彎曲纏繞、排列紊亂

6、，軸突生長(zhǎng)錐塌陷，更嚴(yán)重的是部分細(xì)胞骨架蛋白斷裂，失去正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
　　3.與空載對(duì)照組相比，WT SEMA3C組的Neuro-2a細(xì)胞遷移率明顯增加，與WT組相比，突變組(S329G SEMA3C、V337M SEMA3C、P615T SEMA3D)的細(xì)胞遷移率明顯降低。
　　4.與空載對(duì)照組相比，WT SEMA3C作用下的ENCC分化為神經(jīng)元/成熟神經(jīng)元的能力均明顯增強(qiáng);與WT相比，突變型SEMA3C作用下的ENCC

7、分化為神經(jīng)元/成熟神經(jīng)元的能力均有下降的趨勢(shì)，其中以V337M SEMA3C處理組的下降最為明顯。而在SEMA3D處理組中，WT和突變型SEMA3D作用下的ENCC分化為神經(jīng)元/成熟神經(jīng)元的能力均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。
　　5.SEMA3C/3D各處理組中的ENCC神經(jīng)球均可以穿過Transwell小室的基底膜，其遷移能力沒有明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.P615T SEMA3D可通過下調(diào)p-cofilin蛋白表達(dá)