先天性巨結(jié)腸癥相關(guān)病因機制研究.pdf

1、先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprungdisease，HD)又稱腸無神經(jīng)節(jié)細胞癥，是一種神經(jīng)嵴細胞源性疾病和多基因遺傳病，其主要病因是患兒在胚胎期神經(jīng)發(fā)育過程中，神經(jīng)嵴細胞遷移障礙，腸神經(jīng)發(fā)育出現(xiàn)停頓，腸壁肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)節(jié)細胞缺失，以致受累腸段異常收縮，其近端結(jié)腸代償性擴張與肥厚，形成巨結(jié)腸。HD是新生兒期低位腸梗阻常見原因之一，發(fā)病率占成活新生兒的1/5000。 在先天性巨結(jié)腸癥患者中，70％的患者為單發(fā)，12％的病例合并

2、常染色體疾病，18％的病例合并有其他先天性畸形。對單純性HD的研究表明，HD患者同胞的發(fā)病根據(jù)性別和無神經(jīng)節(jié)腸段的長度不同，其再發(fā)病率為1％～33％，因此HD被認為是性修飾多因素遺傳病。其中基因因素的影響發(fā)揮著非常重要的作用。至今為止已發(fā)現(xiàn)原癌基因RET以及分別編碼膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcalline-derinedneurotrophicfactor,GDNF)，內(nèi)皮素β受體(endothelinβreceptor，ED

3、NRB)，內(nèi)皮素3(endothelin3，EDN3)，內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1(endothelinconvertingenzyme1，ECE1)，neurturin(NTN)，轉(zhuǎn)錄因子SOX10以及SIP1(smad-interactingprotein1)等基因與HD有關(guān)。同時微環(huán)境變化導(dǎo)致神經(jīng)嵴細胞分化障礙引起HD這一學說越來越引起人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)很多促進軸突生長和/或生長導(dǎo)向因子，如神經(jīng)生長因子、成纖維細胞生長因子、細胞粘附因子(C

4、AMs)，其中，CAM可通過介導(dǎo)細胞-細胞之間的相互作用而調(diào)節(jié)多種細胞的生長和發(fā)育?，F(xiàn)在已充分地認識到FGFR-CAM同源性結(jié)構(gòu)域在所有FGFRs與N-cadherin，NCAM以及L1CAM間具有高度的保守性。 一、細胞粘附分子CAMs在先天性巨結(jié)腸中的表達研究 有些神經(jīng)節(jié)細胞缺如是神經(jīng)嵴細胞移行到正常位置后由于微環(huán)境變化導(dǎo)致分化障礙而引起的[23]。軸突的方向性生長與微環(huán)境密切相關(guān)是突觸形成的基礎(chǔ)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多促進

5、軸突生長和/或生長導(dǎo)向因子，如神經(jīng)生長因子、成纖維細胞生長因子、細胞粘附因子(CAMs)如NCAM，L1CAM以及N-calherin等。細胞粘附因子(CAM)通過介導(dǎo)細胞-細胞之間的相互作用而調(diào)節(jié)多種細胞的生長和發(fā)育，近來有研究發(fā)現(xiàn)CAM通過與成纖維細胞生長因子受體(FGFR)結(jié)合(CAM-FGFR信號傳遞)途徑而刺激神經(jīng)元突起的生長。 鑒于考慮CAM-FGFR信號傳遞發(fā)生改變可能是導(dǎo)致HD主要神經(jīng)元異常的原因之一，本課題選取

6、NCAM、N-cadherin兩種細胞粘附分子，研究它們在HD腸壁中的表達情況，初步探討CAM-FGFR信號傳導(dǎo)在HD致病機理中的作用。我們根據(jù)HE和AchE染色，將16例HD患者的標本分別分為神經(jīng)節(jié)正常腸段(ganglionicsegments，NG)和神經(jīng)節(jié)缺如腸段(aganglionicsegments,AG)兩組，進行免疫組織化學染色。觀察了HD患者細胞粘附分子(CAMs)分別在HD神經(jīng)節(jié)正常腸段和神經(jīng)節(jié)缺如腸段的表達情況。結(jié)果

7、發(fā)現(xiàn)細胞粘附分子NCAM在神經(jīng)組織和平滑肌組織中都有表達，但NG腸段腸組織中NCAM染色的正常的神經(jīng)纖維的數(shù)量明顯多于AG腸段；細胞粘附分子N-cadherin在神經(jīng)組織和平滑肌中也都有表達，且同樣在NG腸段平滑肌中N-cadherin染色的正常的神經(jīng)纖維數(shù)量明顯要多。結(jié)果表明細胞粘附分子(CAMs)在AG腸段的明顯減少說明HD患者中CAM-FGFR信號傳導(dǎo)發(fā)生了異常，且可能是導(dǎo)致腸神經(jīng)母細胞移行障礙的原因之一。 二、RET基因

8、多態(tài)性與中國漢族人群先天性巨結(jié)腸的相關(guān)性研究 相對環(huán)境而言，遺傳因素在HD發(fā)生中起著更為重要的作用。RET原癌基因是最早發(fā)現(xiàn)，證據(jù)最確鑿，作用最重要的與HD相關(guān)的基因。它定位于10q11.2，長約80kb，有20個外顯子，編碼產(chǎn)物為酪氨酸蛋白激酶受體。目前在HD病人中發(fā)現(xiàn)RET的突變性分散，無熱點區(qū)域存在，極少數(shù)為大片段缺失，多為點突變、錯義、無義和移碼突變。20個外顯子中，在西方人群已發(fā)現(xiàn)有7個常見的基因多態(tài)性，其中第45位密

9、碼子(GCG→GCA)和第769位密碼子(CTT→CTG)的基因多態(tài)性與HD表型顯著相關(guān)[1，2]，但由于遺傳背景等方面的差異，這一點需要在不同的人種和種族中進行證實，而有關(guān)RET基因多態(tài)性及基因頻率在亞洲人群中的分布還未見報道。 鑒于還無亞洲人群的RET基因多態(tài)性及其與HD的相關(guān)性研究，研究應(yīng)用PCR-RELP在中國人群中檢測對照組(n=122)及散發(fā)性先天性巨結(jié)腸組(n=94)G45A(GCG→GCA)、T769G(CTT→

10、CTG)、G691A(GGGT→AGT)和C904G(TCC→TCG)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)分析了94例HD患者和122例健康人其中G45A(GCG→GCA)，T769G(CTT→CTG)，G691A(GGT→AGT)和C904G(TCC→TCG)四個位點的基因多態(tài)性，探討其基因多態(tài)性與先天性巨結(jié)腸的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)G45A、T769G和G691A在中國人群中均存在多態(tài)性，

11、但未發(fā)現(xiàn)C904G在中國人群中存在基因多態(tài)性，均為CC型。G45A在正常對照和疾病組中基因型頻率分別為：對照組，AA0.17、AG0.72、GG0.11，突變型A和野生型G等位基因的頻率為0.53、0.47；HD組，AA0.61、AG0.35、GG0.04，突變型A和野生型G等位基因的頻率為0.78、0.22；T769G在正常對照和疾病組中基因型頻率分布分別為：對照組，GG0.30、GT0.52、TT0.18，G和T等位基因的頻率為0.

12、56、0.44；HD組，GG0.49、GT0.36、TT0.15，突變型G和野生型T等位基因的頻率為0.67、0.33。兩個位點的基因型和等位基因的分布頻率在兩組間均有顯著性差異(ax2=28.64，p＜0.001；bx2=5.27，p=0.022)。G691A在正常對照和疾病組中基因型頻率分別為：對照組，AA0.05、AG0.16、GG0.79，突變型A和野生型G等位基因的頻率為0.13、0.87；HD組，AA0.02、AG0.14、

13、GG0.84，突變型A和野生型G等位基因的頻率為0.09、0.91，在兩組間未見有顯著性差異(cX2=1.232，p=0.267)。結(jié)果表明RET密碼子904在中國人群中可能不存在基因多態(tài)性，未發(fā)現(xiàn)G691A與先天性巨結(jié)腸存在相關(guān)性，而G45A和T769G的基因多態(tài)性可能與中國漢族人群先天性巨結(jié)腸相關(guān)。 三、RET基因啟動子單核苷酸多態(tài)性對基因表達影響的研究 胚胎發(fā)育期間RET信號傳導(dǎo)通路的激活對于腸神經(jīng)系統(tǒng)前體干細胞的

14、定向遷移是非常重要的。在家族性和散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥病例中均發(fā)現(xiàn)有不同頻率的RET基因功能散失性的胚系突變。而且在白種人群和本實驗第二部分中均證實在先天性巨結(jié)腸癥病患中RET基因上的一些基因多態(tài)性的等位基因存在過度表達或降低表達的現(xiàn)象。 基因啟動子區(qū)域的某些特定的等位基因能影響基因的表達，因而可能導(dǎo)致一些復(fù)雜疾病的易患性。本課題擴增RET基因上游啟動子區(qū)域的片段，克隆入pGEM-T載體，用pfx高保真酶測序進行單核苷酸多態(tài)性檢測

15、(SNP)，發(fā)現(xiàn)在中國湖北地區(qū)漢族人群中，啟動子-6存在G＞A單核苷酸多態(tài)性。并通過測序?qū)z測到的單核苷酸多態(tài)性的純合子區(qū)分出來(-6AA或-6GG)，進而構(gòu)建雙重蟲熒光素酶報告基因系統(tǒng)研究這個SNP對基因轉(zhuǎn)錄的影響。即分別構(gòu)建含有這個單核苷酸多態(tài)性位點純合子的蟲熒光素酶報告基因質(zhì)粒A-pGL3Basic和B-pGL3Basic，并將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的神經(jīng)母細胞瘤細胞IMR32，檢測兩個體系的蟲熒光素酶相對表達量。結(jié)果，含A純合子等

16、位基因啟動子的IMR32熒光素酶相對表達量為1.58±0.15，含G純合子等位基因啟動子的IMR32熒光素酶相對表達量為4.14±0.35，G等位基因?qū)epG2熒光素酶相對表達量的影響明顯高于A等位基因(p＜0.001)，說明-6G＞A單核苷酸多態(tài)性與RET啟動子的活性密切相關(guān)，能影響mRNA的轉(zhuǎn)錄。 先天性巨結(jié)腸癥基礎(chǔ)研究進展 先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprungdisease，HD)又稱腸無神經(jīng)節(jié)細胞癥，是一種

17、神經(jīng)嵴細胞源性疾病和多基因遺傳病。隨著分子遺傳學、神經(jīng)化學、組織化學和發(fā)展，對先天性巨結(jié)腸癥的病理改變、遺傳基礎(chǔ)、微環(huán)境因素等都有了進一步的明確，現(xiàn)結(jié)合近年來的進展綜述如下。 先天性巨結(jié)腸癥(hirschsprung'sdisease，HD)是一種小兒外科比較常見的腸道發(fā)育畸形，發(fā)病率為12000～15000，男女之比為4∶1。其主要的臨床表現(xiàn)為患兒胎糞排出延遲，頑固性便秘和腹脹，常并發(fā)小腸結(jié)腸炎，低位性腸梗阻，嚴重的影響患兒的