可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑在TGF-β1誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、背景:
　　心肌纖維化（cardinal fibrosis，MF）是指在多種病理因素作用下心肌成纖維細(xì)胞的過度增殖、膠原纖維的過度沉積、比例失調(diào)及異常分布所致的心臟間質(zhì)重構(gòu)。MF是心臟對各種刺激產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，也是心肌缺血、心肌病、心力衰竭、糖尿病、高血壓、肺動脈高壓等多種心血管疾病發(fā)展至一定階段共同的病理生理改變。多種機(jī)制參與心肌纖維化的進(jìn)程，包括腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldoste

2、rone system, RAAS)、內(nèi)皮素(endothelin, ET)、核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β1，TGF-β)等。減少心肌重構(gòu)能夠改善患者的預(yù)后，因此尋找特異性的抗心肌纖維化藥物,減少心肌重構(gòu)成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。
　　近些年來,隨著對心肌纖維化發(fā)生機(jī)制認(rèn)識的逐步深入，內(nèi)

3、皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial mesenchymal transition，EndMT）在心肌纖維化中的作用受到越來越多研究者的重視。內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化屬于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）的一種特殊類型，是內(nèi)皮細(xì)胞在多種因素刺激下逐漸失去其形態(tài)和功能，向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化并獲得增殖、遷移及合成膠原等功能的過程。TGF-β信號、Notch信號、Wnt信號、MicroRNAs及

4、一些炎癥因子等可能參與EndMT的調(diào)節(jié)，其中TGF-β1/Smads信號通路是研究最為深入的一種。
　　環(huán)氧化物水解酶(epoxide hydratase,EH)普遍存在于哺乳動物體內(nèi)，作用于心血管疾病的多個環(huán)節(jié),具有舒張血管、抗炎、刺激血管形成等作用?？扇苄原h(huán)氧化物水解酶抑制劑(soluble epoxied hydrolase inhibitor，sEHI)是EH的抑制劑，參與抑制多環(huán)芳烴環(huán)氧化物、環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxy

5、eicosatrienoic acid,EET)等環(huán)氧化物的代謝，它具有抗心肌纖維化、調(diào)節(jié)血脂、抗高血壓及減少心肌缺血再灌注損傷等作用。然而sEHI是否可以通過抑制EndMT發(fā)揮抗心肌纖維化作用及其抗纖維化作用是否是通過抑制TGF-β1/Smads信號通路來實(shí)現(xiàn)尚無人報道。
　　目的:
　　本研究采用TGF-β1誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein epithelial cell，HUVEC-12）

6、發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并給予不同劑量的t-AUCB進(jìn)行干預(yù)。通過 CCK-8法觀察細(xì)胞活性，real time RT-PCR檢測內(nèi)皮、間質(zhì)標(biāo)志物和TGF-β1/Smads下游轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)，光鏡觀察HUVEC-12細(xì)胞形態(tài)，Western blot檢測 Smad2/3的磷酸化水平。初步探討t-AUCB抗纖維化作用與TGF-β1/Smads信號通路的相關(guān)性，為t-AUCB抗心肌纖維化的應(yīng)用提供細(xì)胞實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法:

7、>　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC-12購自YRGene（NC006），在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行6h的饑餓處理。然后將其分為四組：對照組（無血清DMEM培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng)）、TGF-β1組（含10μg/LTGF-β1的無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)72h）、t-AUCB干預(yù)組（先采用含50μmol/Lt-AUCB無血清 DMEM培養(yǎng)液預(yù)保護(hù)40min，后采用含10μg/LTGF-β1及50μmol/L

8、t-AUCB的無血清DMEM培養(yǎng)液共同培養(yǎng)72h）、t-AUCB（含50μmol/Lt-AUCB無血清DMEM培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng)72h）。各組細(xì)胞培養(yǎng)24h時，采用Western blot檢測各組細(xì)胞Smad2/3的磷酸化水平。各組細(xì)胞培養(yǎng)72h時，應(yīng)用細(xì)胞毒性試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測細(xì)胞活性；光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；實(shí)時熒光定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）檢測內(nèi)皮標(biāo)志物CD31

9、及間質(zhì)標(biāo)志物collagen I、collagenIII、vimentin的基因表達(dá)和TGF-β1/Smads信號通路中下游轉(zhuǎn)錄因子snail1、twist1、twist2、ZEB1的基因表達(dá)。
　　結(jié)果:
　?。?）TGF-β1（10μg/L）和/或t-AUCB（1、10、50μmol/L）對細(xì)胞活性影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）。
　　（2）real time RT-PCR結(jié)果提示，TGF-β1（10μg/

10、L）誘導(dǎo)培養(yǎng)HUVEC-12細(xì)胞72 h后，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31的基因表達(dá)顯著下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)記物collagen I、collagen III、vimentin的基因表達(dá)則顯著上調(diào)；TGF-β1（10μg/L）與t-AUCB（1、10、50μmol/L）共同干預(yù)細(xì)胞72 h后可顯著逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象，且具有濃度依賴性（P均<0.05）。
　?。?）光鏡結(jié)果示，對照組細(xì)胞光鏡下為鵝卵石形，細(xì)胞間連接緊密；TGF-β1干預(yù)組細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楠M長形

11、，細(xì)胞間隙疏松；TGF-β1與t-AUCB（50μmol/L）聯(lián)合干預(yù)細(xì)胞及單用t-AUCB干預(yù)細(xì)胞72h后，細(xì)胞形態(tài)與對照組相似。
　?。?）Western blot結(jié)果提示，TGF-β1（10μg/L）干預(yù)HUVEC-12細(xì)胞72h后可顯著提高Smad2/3的磷酸化水平，t-AUCB（50μmol/L）則可顯著逆轉(zhuǎn)上述變化（P均<0.05）。
　?。?）real time RT-PCR結(jié)果提示，與對照組相比，TGF-β1

12、（10μg/L）誘導(dǎo)組細(xì)胞下游轉(zhuǎn)錄因子snail1、twist1、twist2、ZEB1的基因表達(dá)顯著增高；t-AUCB（50μmol/L）與TGF-β1（10μg/L）聯(lián)合干預(yù)時則可顯著抑制上述基因的表達(dá)（P均<0.05）。
　　結(jié)論
　?。?）TGF-β1可誘導(dǎo)的HUVEC-12細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化。
　?。?）t-AUCB對HUVEC-12細(xì)胞發(fā)生EndMT無明顯影響。
　?。?）t-AUCB可抑制