RNA干擾下調(diào)可溶性環(huán)氧化物水解酶對(duì)急性心肌缺血壞死的影響.pdf

1、研究背景和目的:急性心肌缺血壞死影響了心肌的收縮及舒張功能，可導(dǎo)致心律失常、心力衰竭、猝死等心血管事件的發(fā)生。近年來，可溶性環(huán)氧化物水解酶（she）作為心血管疾病的治療靶點(diǎn)受到關(guān)注，研究表明，抑制she可使缺血、缺氧的心肌細(xì)胞凋亡減少，從而使心肌梗死面積縮小、促進(jìn)心功能的恢復(fù)，緩解慢性壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚和防治心肌重構(gòu)。目前，應(yīng)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)來抑制she的表達(dá)，從而起到保護(hù)心血管系統(tǒng)作用的報(bào)道尚少。RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后

2、基因沉默機(jī)制，即mRNA被相應(yīng)的小干擾RNA(siRNA)結(jié)合后發(fā)生降解或被封閉，從而阻止mRNA修飾和翻譯。RNAi這種于轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控，具有高度特異性、高效性和低毒性等特點(diǎn)，微量的siRNA就可使目的基因的表達(dá)顯著下降。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建靶向she基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，培養(yǎng)小鼠原代心肌細(xì)胞，并通過將siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞的方法，篩選出針對(duì)she基因特異性沉默效果較好的siRNA表達(dá)質(zhì)粒。用篩選出的質(zhì)粒抑

3、制心肌細(xì)胞she的表達(dá)，觀察其對(duì)異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響。將篩選出的siRNA表達(dá)質(zhì)粒注入小鼠體內(nèi)，然后采用高劑量異丙腎上腺素腹腔注射的方法，建立小鼠急性心肌缺血模型，觀察心肌組織she的表達(dá)能否被顯著下調(diào)，以及當(dāng)小鼠體內(nèi)的she表達(dá)被抑制后，對(duì)急性缺血損傷的心肌和心功能的影響，還有對(duì)心肌組織凋亡相關(guān)基因Bcl-2及Bax的表達(dá)水平產(chǎn)生的影響，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 第一部分 BALB/c小鼠乳鼠原代

4、心肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 目的：建立分離、純化和培養(yǎng)BALB/c小鼠乳鼠心肌細(xì)胞的方法。
　　 方法：取出生1-3d以內(nèi)的BALB/c小鼠乳鼠心肌組織，用0.125％ 胰蛋白酶和0.1％的Ⅰ型膠原酶進(jìn)行消化，將心肌細(xì)胞收集到含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，用差速貼壁分離法同5-溴脫氧尿苷相結(jié)合的方法，以分離和純化心肌細(xì)胞。通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)的α-actin進(jìn)行免疫組化染色的方法，來鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞是否為心肌細(xì)胞。

5、r>　　 結(jié)果：16-24h后可見散在的單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞搏動(dòng)，2-3d后可見細(xì)胞相互連接，出現(xiàn)同步、有節(jié)律的搏動(dòng)；經(jīng)過對(duì)細(xì)胞內(nèi)的α-actin免疫組化染色鑒定后，確認(rèn)培養(yǎng)的細(xì)胞基本都是心肌細(xì)胞。
　　 結(jié)論：通過本研究應(yīng)用的方法，可培養(yǎng)、獲得狀態(tài)良好的BALB/c小鼠原代心肌細(xì)胞，是一種可靠的心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法。
　　 第二部分 RNA干擾下調(diào)小鼠心肌細(xì)胞可溶性環(huán)氧化物水解酶的表達(dá)
　　 目的：構(gòu)建靶向可溶性環(huán)氧化

6、物水解酶(she)基因的pSUPER.retro.neo表達(dá)質(zhì)粒，其內(nèi)含有特異性靶向she的RNA干擾序列，以選擇性下調(diào)小鼠原代心肌細(xì)胞she的表達(dá)，并篩選出抑制she效果最明顯的表達(dá)質(zhì)粒。
　　 方法：設(shè)計(jì)異性靶向she的小干擾RNA(siRNA)序列，構(gòu)建2個(gè)含有該特異性siRNA序列的質(zhì)粒 (EH-1、EH-2)。以含非特異性siRNA編碼序列的PCN質(zhì)粒為陰性對(duì)照(PCN組)，用FuGENE HD將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入培養(yǎng)的原代

7、心肌細(xì)胞，并設(shè)空白對(duì)照組（C組）。轉(zhuǎn)染后，通過半定量RT-PCR和Western blotting法，檢測(cè)各組心肌細(xì)胞she的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：在C組、PCN組和EH-1組，心肌細(xì)胞she的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均無降低；與這些組相比，在EH-2組，可觀察到心肌細(xì)胞she的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明質(zhì)粒EH-2為抑制she效果最明顯的表達(dá)質(zhì)粒，重新命名為EH-R。
　　 結(jié)

8、論：可以通過構(gòu)建含特異性siRNA序列的質(zhì)粒，利用RNAi技術(shù)成功下調(diào)了原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中she的表達(dá)。
　　 第三部分 RNA干擾下調(diào)可溶性環(huán)氧化物水解酶表達(dá)對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的：應(yīng)用抑制she效果最明顯的表達(dá)質(zhì)粒EH-R，抑制心肌細(xì)胞的she表達(dá)；觀察其對(duì)異丙基腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡及相關(guān)基因的影響。
　　 方法：以含非特異性siRNA編碼序列的質(zhì)粒（PCN）為

9、陰性對(duì)照，用FuGENE HD轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，利用抑制she效果最明顯的表達(dá)質(zhì)粒EH-R，下調(diào)心肌細(xì)胞she基因的表達(dá)。采用濃度為10μmol/L的ISO誘導(dǎo)心肌凋亡，心肌細(xì)胞被分為四組：正常對(duì)照組、ISO組、PCN+ISO組和EH-R+ISO組。觀察抑制she后，對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的發(fā)生率，Western blotting法檢測(cè)各組Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果

10、：與正常對(duì)照組相比，應(yīng)用ISO的各組的心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高，并且心肌細(xì)胞的Bax表達(dá)升高，而Bcl-2表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，EH-R+ISO組與ISO組、PCN+ISO組相比較，心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低，心肌細(xì)胞的Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高。
　　 結(jié)論：應(yīng)用質(zhì)粒EH-R成功下調(diào)了原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中she的表達(dá)，從而相對(duì)增加了抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，減輕了ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡。
　　 第四部

11、分 RNA干擾下調(diào)可溶性環(huán)氧化物水解酶表達(dá)對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的急性心肌缺血壞死的影響
　　 目的：應(yīng)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)下調(diào)BALB/c小鼠體內(nèi)的可溶性環(huán)氧化物水解酶（she）的表達(dá)，觀察抑制she表達(dá)后，對(duì)異丙基腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的急性缺血心肌和心功能的影響，并觀察心肌組織凋亡相關(guān)基因的變化。
　　 方法：采用20mg/kg/d的ISO連續(xù)腹腔注射三天，建立BALB/c小鼠急性心肌缺血模型。小鼠分為四組：正

12、常對(duì)照組（C組）、心肌缺血組（MI組）、心肌缺血加陰性質(zhì)粒處理組（PCN組）和心肌缺血加EH-R質(zhì)粒處理組（EH-R組）。利用前面實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建好的靶向she基因的特異性小干擾RNA質(zhì)粒EH-R，來下調(diào)小鼠she基因的表達(dá)，用心臟超聲測(cè)定各組左室射血分?jǐn)?shù)（EF％），左室短軸縮短率（FS％），舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）等的變化。取心肌組織進(jìn)行HE染色，觀察各組心肌組織缺血壞死的變化情況；Western blotting法檢測(cè)各組心肌組織Bcl

13、-2、Bax和she的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，各心肌缺血組的心肌組織Bax表達(dá)升高，而Bcl-2表達(dá)下降；并且心肌組織缺血壞死明顯，心臟超聲顯示心功能受損，EF％和FS％降低，LVEDd增大。而心肌缺血加EH-R質(zhì)粒組（EH-R組）與MI組和PCN組相比較，心肌組織的she和Bax的表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高；心肌缺血壞死明顯減輕，心臟超聲顯示：EF％、FS％升高，LVEDd減小。
　　 結(jié)論：應(yīng)用R