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文檔簡介
1、[目的]
可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)是花生四烯酸代謝的關(guān)鍵酶之一,參與機(jī)體內(nèi)炎癥、癌變和心血管系統(tǒng)病變等多種病理過程。抑制sEH,可以起到抗炎、抗動脈粥樣硬化、降血壓和抗癌的作用,因此sEH成為了抗炎、抗動脈粥樣硬化等藥物開發(fā)的新靶點(diǎn)。目前已開發(fā)的sEH抑制劑均為化學(xué)合成,代謝快,毒性高,成本高,應(yīng)用價(jià)值較低。本課題以sEH為靶點(diǎn),從天然藥物成分中篩選低毒高效的sEH
2、抑制劑,探討其抑制機(jī)理,并觀察其抗炎作用,為開發(fā)新的天然類抑制劑打下基礎(chǔ)。
[方法]
1.選擇三種細(xì)胞:小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC和人肝癌細(xì)胞株Huh7,建立最佳培養(yǎng)條件,比較三種細(xì)胞內(nèi)酶活性,選擇適合的細(xì)胞建立sEH抑制劑篩選模型;
2.選擇一系列具有抗癌、抗炎、降血壓、降血脂等中藥或單體等作為待選藥物,MTT法檢測細(xì)胞毒性確定低毒性藥物濃度;
3
3、.每種藥物選擇兩個低毒性濃度,使用商品化的試劑盒測定藥物處理后細(xì)胞內(nèi)sEH酶活性,與溶劑對照組比較,確定藥物對酶活性影響;
4.針對篩選出的藥物,設(shè)計(jì)濃度梯度進(jìn)行進(jìn)一步的酶活性抑制檢測,檢測酶活性抑制是否具有劑量依賴性,并確定最佳濃度;
5.使用每種藥物的最佳濃度,檢測藥物對直接酶活性的抑制作用,RT-PCR和Western bloting檢測藥物對sEH mRNA和蛋白水平的影響。
6.脂多糖
4、LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7建立炎癥模型,檢測篩選藥物對炎癥模型的影響:Griess法檢測一氧化氮的變化,DCFH-DA熒光探針檢測活性氧的變化,ELISA法檢測白介素-1和腫瘤壞死因子α的變化,EIA法檢測篩選藥物對花生四烯酸COX-2通路關(guān)鍵酶COX-2活性的影響,RT-PCR和Western bloting檢測藥物對COX-2基因表達(dá)。
[結(jié)果]
經(jīng)比較,肝癌細(xì)胞Huh7可作為sEH抑制劑篩選
5、模型,通過可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑篩選模型,篩選出原花青素、青藤堿、槲皮素、黃芩素、木犀草素5種藥物劑量依賴性抑制sEH酶活性;探討藥物對酶活性抑制機(jī)理,這些藥物對sEH直接酶活性無明顯抑制作用,而對sEH mRNA和酶蛋白表達(dá)均有明顯抑制作用。原花青素和木犀草素能有效降低炎癥模型中一氧化氮、活性氧、白介素-1β和腫瘤壞死因子α等一系列炎癥因子的水平,下調(diào)COX-2活性和基因表達(dá)。
[結(jié)論]
成功建立sEH
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