動脈粥樣硬化患者外周血可溶性環(huán)氧化物水解酶水平及其對膽固醇代謝的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述:
　　第一部分:動脈粥樣硬化患者外周血可溶性環(huán)氧化物水解酶表達水平研究
　　目的:
　　在我國動脈粥樣硬化患者中進行可溶性環(huán)氧化物水解酶檢測，探討動脈粥樣硬化患者血脂水平，冠心病患者超聲心動指標與外周血可溶性環(huán)氧化物水解酶水平相關(guān)性。
　　方法:
　　(1)根據(jù)動脈粥樣硬化臨床診斷標準，在就診于我院門診及住院的患者中篩選AS患者，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者，并隨機篩選同期就

2、診于我院健康體檢中心年齡、性別比例匹配的健康對照者;
　　(2)查閱文獻并進行調(diào)查問卷設(shè)計，收集患者各項生化檢查及超聲心動檢查指標，簽署知情同意書;
　　(3)采集外周靜脈血，4℃離心取上層血清樣品檢測入組患者及健康對照者中外周血sEH水平，并進行統(tǒng)計學分析;
　　(4)使用Spearman相關(guān)分析進一步分析患者sEH水平與血清學指標以及超聲心動指標之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　(1)自2014年1月至2

3、015年6月，參考AHA關(guān)于動脈粥樣硬化診斷標準，篩選就診于我院動脈硬化門診的粥樣硬化病人214例，冠心病病人138例，并篩選同期就診于我院健康體檢中心，且年齡性別比例匹配的健康成人182例;
　　(2)各組患者年齡、性別匹配，對此進行均衡性檢驗，結(jié)果顯示年齡組(P=0.231＞0.05)，性別組(P=0.844＞0.05)兩組比較均無統(tǒng)計學意義，年齡、性別均衡，組間具有可比性;
　　(3)我們對入組患者及健康對照進行組間相

4、關(guān)性的顯著性檢驗，判斷與疾病密切相關(guān)的病因因素。由于變量較多，首先采用單因素分析，發(fā)現(xiàn)在我們關(guān)注的16項可疑因素中，有6項是與研究疾病有關(guān)聯(lián)的。由于血糖值無法用兩項分類，因此我們對上述指標采用定量分析方法。受教育程度和職業(yè)屬于等級分類指標，采用了秩和檢驗。由表1-5可知:吸煙(P＜0.001)、總膽固醇(P=0.004＜0.05)、甘油三酯(P=0.021＜0.05)、低密度脂蛋白(P＜0.001)、高血壓病(P＜0.001)具有統(tǒng)計學

5、意義;
　　(4)我們使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測三組患者外周血sEH表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對照組（0.21±0.02）ng/ml相比，AS組（128.48±19.42）ng/ml及CHD組（131.21±18.52）ng/ml患者外周血sEH水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(F=28.32，P=0.001)，而AS組及CHD組患者比較，未見明顯統(tǒng)計學差異(F=1.87，T=0.33);
　　(5)對三組患者超聲心動指標進行

6、檢測及統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，CHD組患者EF為（45.4±4.6）％，明顯低于單純AS者（58.3±8.5）％及健康對照（60.9±4.2）％，而CHD患者(58.7±3.5)mm及AS組(58.2±2.8)mm左心室舒張末期徑(LVEDD)明顯高于及健康對照者(52.3±5.3)mm，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);
　　(6)進一步使用方差齊性檢驗對血糖等數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。將數(shù)值輸入SPSS20.0統(tǒng)計學軟件中得出結(jié)果（見表1

7、-8），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，日靜坐時間、空腹血糖均無統(tǒng)計學意義，只有日體力活動時間(P=0.001＜0.05)是AS相關(guān)因素。受教育程度非兩項分類，而是用等級分類，對此采用秩和檢驗，見表1-9結(jié)果顯示:Z=1.839＜1.96，P=0.068＞0.05差別無顯著性，無統(tǒng)計學意義，說明受教育程度并不是AS相關(guān)因素;
　　(7)進一步對職業(yè)性質(zhì)進行秩和檢驗，結(jié)果表明，P＜0.001，說明兩組間差別具有顯著性，職業(yè)是AS相關(guān)因素之一;
　　

8、(8)經(jīng)顯著性檢驗后，確認6項為AS的相關(guān)危險因素。為進一步探討相關(guān)因素與AS相關(guān)性，矯正混雜因素。將多種變量納入多因素分析，最終導入非條件Logistic回歸模型。采用后退法再逐個進行篩選，選入變量的概率標準為0.05，剔除標準為0.05。結(jié)果表明，吸煙、高血壓、職業(yè)、低密度脂蛋白、總膽固醇具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);
　　(9)以sEH為自變量，其余相關(guān)風險因素為因變量，使用Spearman相關(guān)分析對上述數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性進

9、行統(tǒng)計學分析，結(jié)果表明，sEH與高密度脂蛋白呈負相關(guān)，rs=-1.18，y=-1.18x-12.381，而與低密度脂蛋白水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs=0.24，y=0.24x+1.398，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);
　　(10)對入組患者外周血sEH與超聲心動相關(guān)指標進行Spearman相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在CHD患者中，外周血sEH水平與射血分數(shù)EF呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs=-0.12，y(EF)=-0.12x+9.343而與左心

10、室舒張末徑LVEDD呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs=0.16，y(LVEDD)=0.16x-2.587，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。我們認為，監(jiān)測外周血sEH水平對于評估患者心臟重塑具有很好的提示作用。
　　結(jié)論:
　　(1)吸煙、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高血壓病及日體力活動時間都是AS發(fā)生的高危因素，在臨床治療及預(yù)防AS過程中應(yīng)當在藥物治療的同時，改善患者危險因素暴露程度。
　　(2)sEH在AS及CHD患

11、者中表達水平增高，與血清低密度脂蛋白膽固醇水平呈正相關(guān)而與血清高密度脂蛋白膽固醇水平呈負相關(guān)，此外，在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者中，其表達水平與射血分數(shù)EF值呈負相關(guān)，而與左心室舒張末徑呈正相關(guān)，可以在臨床提示動脈粥樣硬化心臟病心臟重塑的發(fā)生。
　　第二部分:可溶性環(huán)氧化物水解酶對細胞膽固醇代謝的研究
　　目的:
　　構(gòu)建野生型及突變型質(zhì)粒，進一步探討編碼可溶性環(huán)氧化物水解酶基因EPHX2對細胞膽固醇代謝的作用。

12、r>　　方法:
　　(1)據(jù)野生型質(zhì)粒WT，構(gòu)建突變型質(zhì)粒并一代測序驗證，體外轉(zhuǎn)染至293T細胞系;
　　(2)收集轉(zhuǎn)染后的WT細胞及轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒的細胞，使用免疫印跡法檢測EPHX2蛋白表達水平，進一步檢測PKA信號通路活化情況;
　　(3)使用可溶性環(huán)氧化物水解酶活性試劑盒檢測細胞中EPHX2的酶活性水平;連續(xù)培養(yǎng)48h后，使用MTT實驗檢測293T細胞的細胞活力;
　　(4)采用流式分析儀檢測EPHX2對LD

13、LR內(nèi)吞LDL功能的影響;并檢測293T細胞細胞周期并進行統(tǒng)計學分析;
　　結(jié)果:
　　(1)以野生型EPHX2載體質(zhì)粒為模板，對進行擴增，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)搖菌擴增提取質(zhì)粒，最終測序證實:所挑克隆為目的基因克隆。
　　(2)可溶性環(huán)氧化物水解酶分子量約為62KDa，而GFP標簽蛋白分子量約28KDa,因此EPHX2-GFP融合蛋白分子量約90KDa左右，在調(diào)整GAPDH一致情況下，正常組即不做任何處理的

14、細胞因無GFP標簽，因此當用GFP標簽抗體檢測時沒有觀察到EPHX2-GFP融合蛋白的存在，而野生型及突變型質(zhì)粒因便于觀察帶有GFP標簽，故在90KDa左右處觀察到融合蛋白的存在。
　　(3)以正常細胞EPHX2的酶活性作為細胞中的本底酶活性。通過瞬時轉(zhuǎn)染野生型及突變型EPHX2質(zhì)粒，過表達EPHX2蛋白，可以檢測到轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒及突變型EPHX2，細胞的總體酶活性明顯較未轉(zhuǎn)染組高，轉(zhuǎn)染突變型EPHX2組可溶性環(huán)氧化物水解酶活性較

15、野生型組顯著降低(P＜0.01)。
　　(4)將正常細胞、轉(zhuǎn)染野生型及突變型質(zhì)粒的細胞鋪在六孔板內(nèi)，1.5μg/mlDil-LDL抗體于37℃孵育4小時，流式細胞儀檢測各組細胞LDLR內(nèi)吞LDL的能力。結(jié)果表明EPHX2顯著影響LDLR內(nèi)吞LDL功能，其LDLR內(nèi)吞LDL能力相對野生型下降25.3％，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　(5)將細胞種在六孔板內(nèi)，Dil-LDL抗體4℃孵育4小時，流式檢測EPHX2對LDLR

16、結(jié)合LDL能力的影響。結(jié)果表明EPHX2可顯著影響LDLR結(jié)合LDL的功能，LDLR結(jié)合LDL能力相對野生型下降19.5％，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　(6)將293T細胞中轉(zhuǎn)入野生質(zhì)粒及突變質(zhì)粒后，在37℃，5％CO2條件的孵育箱中連續(xù)培養(yǎng)48h后，我們發(fā)現(xiàn)，與WT組相比，突變組中293T細胞的增殖速率明顯高于干預(yù)對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Transwell小室法檢測細胞侵襲能力發(fā)現(xiàn)，R287Q組細胞

17、侵襲能力明顯高于WT組及CON組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示突變后293T細胞侵襲能力增強。
　　(7)在轉(zhuǎn)入EPHX2野生型及突變型質(zhì)粒后，檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，與WT組相比，R287Q組細胞S期細胞數(shù)量明顯小于WT組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(8)使用Transwell法檢測R287Q及WT，CON細胞遷徙能力發(fā)現(xiàn)，與0h相比，三組細胞劃痕距離均明顯縮小，但R287Q組縮小程度明顯小于CON及