miR-34a在NK-T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及功能驗證.pdf

1、背景與目的
　　淋巴瘤是目前發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類健康。結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤屬于成熟 T細(xì)胞和 NK細(xì)胞腫瘤中的一種亞型，在西方國家較為少見，但是在亞洲人、墨西哥人和南美土著人中發(fā)病率較高。在我國，此病是最常見的淋巴瘤類型之一。結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤具有獨特的臨床病理特征，臨床具有高度侵襲性，由于病變易復(fù)發(fā)且對放化療易出現(xiàn)抗拒，預(yù)后總體較差。
　　NK/T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病機制的復(fù)雜性及腫瘤的異質(zhì)性加大了診斷與

2、治療的困難。目前國際上沒有對標(biāo)準(zhǔn)化的治療方案達(dá)成共識，因此使得病人的個體化治療難以實現(xiàn)。新的治療方法比如免疫治療、分子靶向治療也在進(jìn)一步探索及研究中。因此，開展NK/T細(xì)胞淋巴瘤的基礎(chǔ)和臨床研究，為臨床提供有效的治療作用靶點，具有重要意義。
　　MicroRNA（簡稱miRNA）是一種長度約22個核苷酸的內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于植物、動物及 DNA病毒中，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA的異常表達(dá)與腫瘤

3、發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，與蛋白編碼基因相同，miRNA也可扮演癌基因或抑癌基因的角色。很多與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲等生物學(xué)過程相關(guān)的基因被證實為 miRNA的靶基因。最近研究證明， miRNA異常表達(dá)與淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，miRNA表達(dá)譜的分析在淋巴瘤診斷、分型及治療靶點的篩選中發(fā)揮重要作用。
　　miR-34a基因定位于染色體1p36，啟動子區(qū)包括P53結(jié)合位點和CpG島，由于P53調(diào)控失?；駽pG島甲基化可導(dǎo)致miR-

4、34a表達(dá)異常。在實體瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-34a大多表達(dá)下調(diào)，miR-34a可以通過靶向調(diào)控細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白激酶抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，還可以通過調(diào)控與細(xì)胞自噬及衰老有關(guān)的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子來影響腫瘤進(jìn)展，因此在大多數(shù)實體瘤中，miR-34a發(fā)揮抑癌基因的作用。但是最近有研究發(fā)現(xiàn)，在一些EBV陽性的淋巴瘤中由EB病毒潛伏膜蛋白（Latent Membrane Protein l，LMP-1）介導(dǎo)的miR-34a表達(dá)上調(diào)，能促進(jìn)腫

5、瘤細(xì)胞增殖，提示 miR-34a發(fā)揮致癌作用。因此 miR-34a發(fā)揮的生物學(xué)功能具有組織特異性。依據(jù)我們課題組前期對NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株以及正常NK細(xì)胞的小RNA高通量深度測序的研究，發(fā)現(xiàn)在SNK-6和YTS細(xì)胞中miR-34a表達(dá)下調(diào)。而目前關(guān)于miR-34a在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及生物學(xué)功能的研究未見其他文獻(xiàn)報道。
　　本課題利用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PC

6、R）技術(shù)檢測miR-34a在NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系及預(yù)后相關(guān)性；通過構(gòu)建高表達(dá)miR-34a及低表達(dá)miR-34a的重組慢病毒載體并進(jìn)行包裝，經(jīng)感染NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系后觀察腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲情況，研究 miR-34a對體外細(xì)胞生物學(xué)特性的影響；體內(nèi)構(gòu)建NK/T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠移植瘤動物模型，與體外細(xì)胞實驗進(jìn)行比較；通過計算機靶基因預(yù)測軟件、熒光素酶報告基因?qū)嶒灱皐estern

7、-blot實驗確定miR-34a作用的可能的靶基因，對靶基因進(jìn)行初步驗證，并研究靶基因發(fā)揮的生物學(xué)功能。課題旨在探討miR-34a在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的作用及意義，尋找與NK/T淋巴瘤診治相關(guān)的新的有效靶點。
　　第一部分 miR-34a在NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)及臨床意義
　　方法：
　　1.收集并篩選鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的石蠟組織標(biāo)本30例，以10例鼻腔粘膜慢性炎的標(biāo)本作為對照組織。
　　2.采用q

8、RT-PCR的方法檢測NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織及對照組織中miR-34a相對表達(dá)量。
　　3.用SPSS軟件對miR-34a表達(dá)與NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，包括年齡、性別、B癥狀、血清LDH水平、Ann Arbor臨床分期及IPI評分。
　　4.單因素及多因素分析miR-34a表達(dá)及以上臨床病理參數(shù)與臨床預(yù)后的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.與對照組相比，NK/T淋巴瘤組織中的miR-3

9、4a的表達(dá)水平明顯降低。
　　2. miR-34a的表達(dá)水平與患者年齡及Ann Arbor臨床分期有關(guān)（P＜0.05），而與患者性別、血清LDH水平、B癥狀及IPI評分無關(guān)（P＞0.05）。
　　3. miR-34a的表達(dá)與患者總生存率無明顯相關(guān)性（P＞0.05），IPI評分≥3分為患者預(yù)后不良的獨立危險因素。
　　第二部分 miR-34a對NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系的生物學(xué)特性影響
　　方法：
　　1.設(shè)計

10、引物，以U6為內(nèi)參，通過RT- PCR的方法檢測正常NK細(xì)胞及NK/T細(xì)胞淋巴瘤SNK-6和YTS細(xì)胞系中miR-34a的表達(dá)量。
　　2.設(shè)計合成Pre-miR-34a片段和anti-miR-34a片段，同時將慢病毒miRNA表達(dá)質(zhì)粒pLenti-miR和慢病毒miRNA封閉質(zhì)粒pLenti-anti-miR經(jīng)過特定酶切位點酶切，與目的片段進(jìn)行無縫克隆，構(gòu)建可以上調(diào) miR-34a表達(dá)及下調(diào)miR-34a表達(dá)的重組慢病毒表達(dá)載體

11、。
　　3.將重組慢病毒載體、包裝質(zhì)?！?.2、包膜質(zhì)粒VSV-G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，經(jīng)過包裝產(chǎn)生病毒原液，并進(jìn)行滴度測定。
　　4.設(shè)計四個實驗組：空白對照組、陰性對照組、miR-34a高表達(dá)組和 miR-34a干擾組，分別利用MTT法、流式細(xì)胞學(xué)及Transwell小室實驗檢測各組感染后的YTS細(xì)胞的生長增殖能力、細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞的侵襲遷移能力。
　　結(jié)果：
　　1. miR-34a在YTS和SNK-6淋巴

12、瘤細(xì)胞株中的表達(dá)與NK細(xì)胞株比較，表達(dá)明顯下調(diào)。
　　2.經(jīng)過PCR鑒定及測序鑒定，成功構(gòu)建了可以上調(diào)及下調(diào)miR-34a表達(dá)的重組慢病毒表達(dá)載體pLenti-miR-34a和pLenti-anti-miR34a。
　　3. MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在感染72h后miR-34a高表達(dá)組、miR-34a干擾組和對照組各組之間兩兩比較，吸光度均有顯著差異（P＜0.05）。與對照組相比， miR-34a高表達(dá)組吸光度顯著降低，而miR

13、-34a干擾組吸光度顯著升高。
　　4.流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-34a高表達(dá)組與陰性對照組、miR-34a干擾組相比，細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5. Transwell小室法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-34a高表達(dá)組、miR-34a干擾組和對照組各組之間兩兩比較，穿膜細(xì)胞數(shù)均有顯著差異（P＜0.05），miR-34a高表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少而miR-34a干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多。

14、>　　第三部分 miR-34a靶基因預(yù)測及功能初步驗證
　　方法：
　　1.利用生物信息學(xué)軟件TargetScan、PicTar和Miranda分別預(yù)測miR-34a作用的靶基因。
　　2.將 pmirGLO載體的雙酶切產(chǎn)物，與目的基因 CD47-3’UTR、MYB-3’UTR、MYC-3’UTR的 PCR產(chǎn)物進(jìn)行無縫克隆，構(gòu)建重組載體 pmirGLO-CD47、pmirGLO-MYB和pmirGLO-MYC。

15、　　3.設(shè)計五個實驗組：pmirGLO-CD47、pmirGLO-MYB和pmirGLO-MYC，陰性對照組PmirGLO-control及空白對照組，分組與Lenti-miR34a慢病毒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶報告基因分析。
　　4.設(shè)計四個實驗組：空白對照組（未感染YTS細(xì)胞）、陰性對照組（Lenti-con）、Lenti-miR34a組和Lenti-anti-miR34a組，各組感染YTS細(xì)胞后，應(yīng)用RT-PCR檢

16、測各處理組 CD47mRNA的相對表達(dá)量，Western Blot實驗檢測各處理組CD47蛋白的表達(dá)水平。
　　5.設(shè)計靶向CD47的shRNA序列并轉(zhuǎn)染至YTS細(xì)胞，RT-PCR及Western Blot實驗檢測轉(zhuǎn)染后CD47的mRNA及蛋白表達(dá)情況。檢測分為細(xì)胞對照組、陰性對照組、mir34a過表達(dá)組和CD47shRNA干擾表達(dá)組，分別利用MTT法、流式細(xì)胞學(xué)及Transwell小室實驗檢測各組感染后的YTS細(xì)胞的生物學(xué)功能。

17、
　　結(jié)果：
　　1.生物信息學(xué)軟件預(yù)測CD47、MYB和MYC為miR-34a可能作用的靶基因。
　　2.經(jīng)過 PCR鑒定及測序鑒定，成功構(gòu)建了重組載體 pmirGLO-CD47、pmirGLO-MYB和pmirGLO-MYC。
　　3.雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，pmirGLO-CD47實驗組熒光素酶活性明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，而 pmirGLO-MYB實驗組和pmirGLO-M

18、YC實驗組差異不具有顯著性(P＞0.05)。證明 miR-34a能夠與CD47的3’UTR區(qū)特異性結(jié)合。
　　4. RT-PCR檢測結(jié)果顯示與對照組相比，Lenti-miR34a組和 Lenti-anti-miR34a組的CD47mRNA表達(dá)水平無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。Western Blot實驗結(jié)果顯示 Lenti-miR34a組、Lenti-anti-miR34a組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Le

19、nti-miR34a感染組細(xì)胞的 CD47蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組，而Lenti-anti-miR34a感染組細(xì)胞的CD47蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組。
　　5.轉(zhuǎn)染CD47-shRNA后，CD47-shRNA組的CD47mRNA水平及蛋白水平均明顯下降，證實慢病毒干擾載體構(gòu)建成功。MTT實驗結(jié)果顯示，miR34a組及CD47-shRNA組與對照組相比，在48h，72h和96h時的細(xì)胞吸光度值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ p<0

20、.05）。流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示， miR-34a組和CD47-shRNA組與對照組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Transwell小室實驗結(jié)果顯示，miR-34a組和CD47-shRNA組較之對照組，遷移穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　第四部分 miR-34a對NK/T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠移植瘤的影響
　　方法：
　　1.建立人NK/T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠移植瘤動物模型。設(shè)

21、計實驗組：陰性對照組、Lenti-miR34a組和 Lenti-anti-miR34a組。觀察各組種植瘤生長情況，測量腫瘤體積并繪制生長曲線。實驗終止時處死小鼠，分離腫瘤。
　　2.采用HE染色、免疫組化和原位雜交方法檢測各組移植瘤病理組織學(xué)形態(tài)、免疫表型及EBV感染情況。
　　3.采用TUNEL法檢測各組移植瘤組織中細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1． Lenti-miR34a組裸鼠移植瘤體積明顯小于對照組和Le

22、nti-anti-miR34a組裸鼠移植瘤體積，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2． HE染色顯示各組移植瘤大體形態(tài)及顯微鏡下組織學(xué)形態(tài)相似。免疫組化顯示各組移植瘤CD3、CD56、Granzyme-B、TIA-1均表達(dá)陽性，CD20表達(dá)陰性。EBER原位雜交顯示各組移植瘤均 EBV陽性。免疫組化結(jié)果顯示Lenti-anti-miR34a組裸鼠移植瘤組織中 CD47蛋白表達(dá)高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；L

23、enti-miR34a組裸鼠移植瘤組織中 CD47蛋白表達(dá)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3． TUNEL結(jié)果顯示與對照組和Lenti-anti-miR34a組相比，Lenti-miR34a組移植瘤組織中凋亡細(xì)胞明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. miR-34a在 NK/T淋巴瘤石蠟組織及細(xì)胞系中的表達(dá)均下調(diào)，提示其可能參與了NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展。

24、　　2.成功構(gòu)建了可以上調(diào)及下調(diào)miR-34a表達(dá)的重組慢病毒表達(dá)載體，體外實驗證實高表達(dá)miR-34a能抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并減低腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　3. CD47是miR-34a直接作用的靶基因，miR-34a能夠與CD47的3’UTR區(qū)特異性結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后負(fù)向調(diào)控，發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)功能。
　　4.成功構(gòu)建了人NK/T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠移植瘤動物模型，體內(nèi)動物實驗與體外細(xì)胞實驗結(jié)果相似，證明mi