芹菜素調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬和凋亡防治動脈粥樣硬化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本課題主要通過動物和細(xì)胞水平，即建立動脈粥樣硬化動物模型和原代巨噬細(xì)胞培養(yǎng)，來研究芹菜素在抗動脈粥樣硬化過程中對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的死亡方式的影響及其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.芹菜素對小鼠動脈粥樣硬化的影響
　　選用ApoE基因敲除小鼠，持續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)，隨機(jī)分為2組（模型組，芹菜素組），加上正常C57小鼠作為對照的正常組，共3組，每組6只，8周齡時，芹菜素組以灌胃方式給藥，喂養(yǎng)8周后，處死

2、所有小鼠，取各組小鼠主動脈、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞行油紅O染色檢測，主動脈作冰凍切片進(jìn)行免疫熒光檢測，觀察芹菜素對小鼠動脈粥樣硬化斑塊的影響。
　　2.F4/80標(biāo)記巨噬細(xì)胞流式檢測腹腔灌洗法巨噬細(xì)胞純化率
　　取正常C57小鼠4只，用腹腔灌洗法獲得原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為2組:對照組和F4/80組，F(xiàn)4/80染色后上流式檢測染色率，以檢測巨噬細(xì)胞純化率。
　　3.芹菜素對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞活力的影響
　

3、　1)用腹腔灌洗法獲得原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為3大組:對照組（Control，C組），OxLDL25μ g/ml(O)組，芹菜素加OxLDL25μg/ml(O+A)組，其中芹菜素組再分為3小組:10μM，25μM，50M，每組6孔。分別培養(yǎng)12小時，24小時，48小時，MTT法檢測細(xì)胞活性，并選出芹菜素最佳作用時間和作用濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2)加入z-VAD檢測芹菜素對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞活力的影響。
　　3

4、)加入3-MA檢測芹菜素對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞活力的影響。
　　4.芹菜素對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡的影響
　　1) AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞凋亡檢測:將原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞隨機(jī)分6小組:DMSO（DMSO為芹菜素的溶劑）組，O組，O+A組，芹菜素+OxLDL+3-MA（O+A+M）組，芹菜素組(A)和3-MA(M)組。使用AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，按說明書操作，經(jīng)FACSCalibur

5、流式細(xì)胞儀檢測，觀察芹菜素對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡的影響。
　　2)TUNEL/DAPI染色法:原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞按上述分組，使用TUNEL凋亡檢測試劑盒，按說明書操作，觀察前用DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。
　　5.MDC染色法檢測自噬小體
　　用腹腔灌洗法獲得原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)按前述分組，MDC染色細(xì)胞，按照文獻(xiàn)中方法操作，于熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。
　　6.Western

6、 blot法分析芹菜素對自噬蛋白、凋亡蛋白及其兩者關(guān)系表達(dá)的影響
　　用腹腔灌洗法獲得原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為:(1)4組:對照組，OxLDL組，芹菜素+OxLDL組，芹菜素+OxLDL+z-VAD(A+O+Z)組。
　　(2)6組，即前述分組。Western blot的操作按本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)步驟進(jìn)行，在KODAKImage Station4000MM Digital Imaging System中曝光成像，用Ima

7、geJ圖像分析軟件分析目的條帶的灰度值，檢測芹菜素對自噬蛋白如LC3B、Bec lin-1等、凋亡蛋白如Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)的調(diào)控。
　　7.ELISA法檢測炎癥因子的表達(dá)
　　1)動物水平:采用ELISA方法檢測小鼠血清腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosisfactor alpha，TNF-α)、白介素-1β(Interleukin1，IL-1β)白介素-6(Interleukin6，IL-6

8、)的蛋白水平。
　　2)細(xì)胞水平:采用ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清（芹菜素作用時間分組為6，12，24小時）中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白水平。
　　3)加入z-VAD檢測炎癥因子TNF-α的表達(dá)變化。
　　8.油紅O染色檢測泡沫細(xì)胞
　　1)腹腔灌洗法取動物實(shí)驗(yàn)中各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，通過油紅O染色檢測視野范圍內(nèi)紅色脂肪滴比例。
　　2)取動物實(shí)驗(yàn)中各組小鼠主動脈進(jìn)行油紅O染色，檢測脂肪染色。

9、
　　9.統(tǒng)計(jì)方法
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表示為:均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）。多組間比較單因素分析采用OneWay-ANOVA，多因素采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，方差齊時，兩組比較采用LSD，當(dāng)方差不齊時，采用Welch穩(wěn)健估計(jì)，再采用Dunnett's T3方法兩兩比較。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.芹菜素有效改善小鼠動脈粥樣斑塊面積
　　取動物實(shí)驗(yàn)中各組小鼠

10、主動脈進(jìn)行油紅O染色，芹菜素組相比于模型組紅色陽性區(qū)域面積明顯減少，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　2.芹菜素有效降低細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)
　　在動物水平，芹菜素組與模型組相比，細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=871.813，P=0.000)，IL-6的表達(dá)差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.523)。在細(xì)胞水平，O+A組與O組相比，TNF-α的表達(dá)水平在芹菜素作用

11、6小時已明顯降低，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，而IL-1β、IL-6的表達(dá)水平在芹菜素作用12小時開始明顯降低，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。
　　3.油紅0染色檢測芹菜素明顯抑制巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞
　　腹腔灌洗法取動物實(shí)驗(yàn)中各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，通過油紅O染色檢測視野范圍內(nèi)，芹菜素組相比于模型組紅色脂肪滴比例明顯降低，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　4.MTT法檢測

12、芹菜素在濃度為25μM、作用時間為48h時細(xì)胞致死率為IC50
　　MTT結(jié)果表明，芹菜素在作用25μM48h時，A組與O+A組相比活力有顯著差異(F=425.521，P=0.000)，達(dá)到半數(shù)致死率IC50，并且隨著時間和濃度的增加，A組與O+A組相比，細(xì)胞活力逐漸降低。
　　5.ELISA檢測芹菜素作用不同時間點(diǎn)對細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響
　　O+A組與O組相比，TNF-α的表達(dá)水平在芹菜素作用6小時已明顯降兩者比較

13、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，而IL-1β、IL-6的表達(dá)水平在芹菜素作用12小時開始明顯降低，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.000)。
　　6.加入Caspase-3抑制劑z-VAD可以抑制芹菜素對細(xì)胞活力的影響，并且阻斷芹菜素對細(xì)胞炎癥因子TNF-α表達(dá)的影響
　　MTT結(jié)果表明，O+A+Z組細(xì)胞凋亡率顯著高于O+A組，同時O+A+Z組中細(xì)胞上清細(xì)胞炎癥因子TNF-α的表達(dá)較O+A組水平升高(P=0.000)。<

14、br>　　7.流式細(xì)胞技術(shù)分析芹菜素對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡的影響，說明芹菜素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡
　　O組與O+A組相比細(xì)胞凋亡率有顯著差異(F=210.261，P=0.001)，O+A組細(xì)胞凋亡率顯著高于DMSO組與O組。加入自噬抑制劑3-MA后，O+A+M組細(xì)胞凋亡率，O+A+M組與O+A組相比細(xì)胞凋亡率有明顯提高（P=0.000）。
　　8.MDC染色檢測芹菜素誘導(dǎo)自噬小體產(chǎn)生，說明芹菜素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡

15、沫細(xì)胞自噬
　　MDC染色結(jié)果顯示:與O組相比，O+A組染上為顯示綠色顆粒狀、點(diǎn)狀聚集的自噬小體顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。與O+A組相比，O+A+M組自噬小體表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，表明自噬得到抑制。
　　9.Western blot法檢測芹菜素誘導(dǎo)凋亡蛋白表達(dá)，說明芹菜素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡
　　與O組相比，在O+A組Caspase-3片段化增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

16、=0.000）。與O+A組相比，O+A+Z組Caspase-3片段化減弱，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　10.Western blot法檢測芹菜素誘導(dǎo)自噬蛋白表達(dá)，說明芹菜素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞自噬
　　與O組相比，在O+A組LC3BⅡ、Beclin-1、Atg-7、Atg-5表達(dá)均增加。與O+A組相比，O+A+M組LC3BⅡ、Beclin-1、Atg-7、Atg-5表達(dá)均降低。
　　11.抑制自噬

17、后，芹菜素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡增加
　　MTT結(jié)果表明，加入自噬抑制劑3-MA后細(xì)胞活力相比于芹菜素組有升高;流式結(jié)果表明，O+A+M組與O+A組相比細(xì)胞凋亡率有顯著提高(P=0.000);TUNEL法檢測結(jié)果表明，O+A+M組與O+A組相比細(xì)胞凋亡率有顯著提高(P=0.000)，O+A+M細(xì)胞凋亡率顯著高于O+A組。Western blot法檢測結(jié)果表明，O+A+M組與O+A組相比，Caspase-3片段化增強(qiáng)，Bax/