水蛭微粉防治動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：通過(guò)構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)大鼠病理模型,觀察水蛭微粉對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠體質(zhì)量、血脂、生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶及血管平滑肌細(xì)胞不同表型標(biāo)志物表達(dá)的影響,探討其防治AS形成的作用及可能機(jī)制。
　　方法：取健康雄性Wistar大鼠32只，適應(yīng)性飼喂1周后隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、水蛭微粉低劑量組、水蛭微粉高劑量組，每組各8只。正常對(duì)照組飼喂普通飼料，其余三組均飼喂高脂飼料，在喂食高脂

2、飼料之前，除正常對(duì)照組外其余各組大鼠一次性腹腔注射維生素 D3注射液60萬(wàn) IU·kg-1建立AS大鼠模型，正常對(duì)照組予以腹腔注射等量生理鹽水；高脂飼喂第二天水蛭微粉各治療組開(kāi)始按各自劑量藥物混懸液灌胃，每天1次，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠只灌胃等量蒸餾水。第5周第一天，高脂飼料各喂養(yǎng)組再次腹腔注射維生素 D3注射液30萬(wàn)IU·kg-1，正常對(duì)照組予以腹腔注射等量生理鹽水。每周稱體質(zhì)量一次，據(jù)體質(zhì)量調(diào)整藥物用量，持續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死

3、所有大鼠，留取血清、主動(dòng)脈等組織，檢測(cè)血清低密度脂蛋膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)及甘油三酯（triglycerides, TG）水平；用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清血小板源生長(zhǎng)因子-BB（platelet

4、 derived growth factor-bb, PDGF-BB）和主動(dòng)脈勻漿基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（ matrix metalloproteinase-9, MMP-9）的表達(dá)；免疫組織化學(xué)法觀察主動(dòng)脈弓血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）表型標(biāo)志物α-肌動(dòng)蛋白（α-actin）和骨橋蛋白（oste

5、opontin, OPN）的表達(dá)；將主動(dòng)脈蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察其病理改變。
　　結(jié)果：1.大鼠一般狀況觀察及體質(zhì)量的改變：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，各組大鼠進(jìn)食、活動(dòng)情況、體質(zhì)量無(wú)明顯差異；造模后，第7周模型對(duì)照組有1只大鼠因厭食、體質(zhì)量下降死亡，其它各組均無(wú)死亡。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，正常對(duì)照組大鼠的進(jìn)食量較穩(wěn)定，體質(zhì)量一直呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；高脂飼料喂養(yǎng)2周后，模型對(duì)照組大鼠進(jìn)食量不同程度下降，體質(zhì)量明顯增長(zhǎng)緩慢，較正常對(duì)照組顯著下降(P＜0.

6、01)；水蛭微粉各治療組較模型對(duì)照組大鼠進(jìn)食量較多，體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，第5周之前體質(zhì)量較模型對(duì)照組明顯增加（P＜0.05或P＜0.01)，第5周之后水蛭微粉治療組較模型組大鼠體質(zhì)量有所增加(P＞0.05)，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.血清血脂水平的改變：模型對(duì)照組較正常對(duì)照組血清TC和LDL-C升高明顯(P＜0.01)，TG有所降低(P＞0.05)，HDL-C升高(P＞0.05)，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組比較，水蛭微粉各治療

7、組TC和LDL-C明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)；水蛭微粉高劑量組較低劑量組TC和LDL-C有所降低(P＞0.05)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；水蛭微粉高劑量組較模型對(duì)照組TG明顯升高(P＜0.05)；水蛭微粉兩治療組較模型對(duì)照組HDL-C有降低趨勢(shì)(P＞0.05)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.血清PDGF-BB表達(dá)水平的變化：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組PDGF-BB的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)；水蛭微粉各治療組較模型對(duì)

8、照組PDGF-BB的表達(dá)量降低明顯(P＜0.05或P＜0.01)；水蛭微粉高劑量組較低劑量組PDGF-BB的表達(dá)水平有所降低(P＞0.05)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.主動(dòng)脈勻漿MMP-2和MMP-9表達(dá)水平的變化：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組主動(dòng)脈MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.01)；與模型對(duì)照組相比，水蛭微粉各治療組 MMP-2和 MMP-9的表達(dá)水平均降低明顯(P＜0.05或P＜0.01)；與水蛭微

9、粉低劑量組比較，水蛭微粉高劑量組MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平有降低趨勢(shì)(P＞0.05)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.主動(dòng)脈弓血管平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物α-actin表達(dá)的變化：正常對(duì)照組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞α-actin陽(yáng)性染色均勻，模型對(duì)照組較正常對(duì)照組α-actin表達(dá)明顯下降（P＜0.05）；各水蛭微粉治療組較模型對(duì)照組α-actin表達(dá)顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；水蛭微粉高劑量組較低劑量組α-actin表達(dá)有所

10、升高(P＞0.05)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.主動(dòng)脈壁OPN表達(dá)的變化：正常對(duì)照組主動(dòng)脈壁OPN幾乎不表達(dá)；模型對(duì)照組較正常對(duì)照組主動(dòng)脈壁OPN表達(dá)明顯增多（P＜0.01）；各水蛭微粉治療組較模型對(duì)照組 OPN表達(dá)顯著減少（P＜0.01）；水蛭微粉高劑量組較低劑量組 OPN表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。
　　7.血清 PDGF-BB與主動(dòng)脈基質(zhì)金屬蛋白酶和平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物相關(guān)性分析：血清PDGF-BB的表達(dá)水平與主

11、動(dòng)脈MMP-2、MMP-9和OPN的表達(dá)水平呈正相關(guān)（P＜0.05），與SM-α-actin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。
　　8.主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化：HE染色可見(jiàn)，正常對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈弓各層結(jié)構(gòu)均正常，內(nèi)膜完整、光滑，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊，彈力纖維排列規(guī)則；模型對(duì)照組主動(dòng)脈弓可見(jiàn)向腔內(nèi)凸起的斑塊，內(nèi)膜增厚，平滑肌細(xì)胞增生，斑塊內(nèi)發(fā)生變性壞死，并有泡沫細(xì)胞形成，膽固醇結(jié)晶沉積；水蛭微粉各治療組主動(dòng)脈病變較模型對(duì)照組均有不同程度減

12、輕，水蛭微粉低劑量組主動(dòng)脈弓內(nèi)膜下可見(jiàn)少量斑塊形成，內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞數(shù)量較少，斑塊內(nèi)可見(jiàn)少量的泡沫細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶沉積；水蛭微粉高劑量組主動(dòng)脈弓中膜內(nèi)可見(jiàn)少量膽固醇結(jié)晶沉積，未見(jiàn)內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增殖，血管腔內(nèi)未見(jiàn)斑塊形成。
　　結(jié)論：高脂飲食聯(lián)合兩次維生素D3注射液腹腔注射成功建立AS大鼠病理模型，符合脂質(zhì)斑塊形成、泡沫細(xì)胞形成、平滑肌細(xì)胞增生、膽固醇結(jié)晶沉積等AS病理改變；水蛭微粉防治AS形成的可能機(jī)制主要表現(xiàn)在：(1)水蛭微粉可減

13、弱高負(fù)荷鈣吸收對(duì)大鼠消化系統(tǒng)和血管內(nèi)皮的損傷，改善大鼠體質(zhì)量和內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，消弱AS的誘因；(2)水蛭微粉可顯著下調(diào)血清TC及LDL-C水平，減輕其對(duì)血管內(nèi)皮的損傷和內(nèi)膜脂質(zhì)沉積；(3)水蛭微粉可降低血清PDGF-BB的表達(dá)，下調(diào)主動(dòng)脈MMP-2、MMP-9的表達(dá)，抑制平滑肌細(xì)胞收縮表型標(biāo)志物α-actin表達(dá)的減少，下調(diào)主動(dòng)脈壁OPN的表達(dá)，抑制基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的降解，減少脂質(zhì)向血管內(nèi)皮浸潤(rùn)和血管平滑肌細(xì)胞的遷移、表型轉(zhuǎn)化，能夠有效