人參皂苷Rb1通過促進巨噬細胞自噬穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的研究.pdf

1、研究背景
　　動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊破裂和血栓形成是導致急性心腦血管事件的主要病理機制，對可能發(fā)生破裂的易損斑塊(vulnerable plaque)進行早期積極干預(yù)是預(yù)防和減低急性心腦血管事件的發(fā)生率的重要方法。AS是一種脂質(zhì)驅(qū)動的慢性炎癥性疾病。其主要病理表現(xiàn)為脂質(zhì)堆積和炎癥細胞浸潤，巨噬細胞在這一過程中發(fā)揮重要作用。血液中的低密度脂蛋白膽固醇被巨噬細胞吞噬后以膽固醇酯的形式存在于脂滴中，蓄積

2、了大量脂質(zhì)的巨噬細胞變?yōu)榕菽毎?。如何減少泡沫細胞中脂質(zhì)的蓄積，對于降低斑塊脂負荷、促進斑塊穩(wěn)定具有重要意義。
　　人參皂苷Rb1是人參當中含量最多的活性成分。目前的研究發(fā)現(xiàn)，Rb1具有降低血脂、降低體重、對抗炎癥、抑制血管形成和增強胰島素敏感性等生理作用。但是，Rb1在動脈粥樣硬化中的作用尚沒有研究。本課題擬通過構(gòu)建AS小鼠模型和體外培養(yǎng)巨噬細胞，探討人參皂苷Rb1通過調(diào)控巨噬細胞自噬對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的作用及其相關(guān)機制。

3、
　　目的
　　通過構(gòu)建體外泡沫細胞模型及動脈粥樣硬化小鼠易損斑塊模型，研究人參皂苷Rb1調(diào)控巨噬細胞自噬、影響脂質(zhì)代謝及穩(wěn)定AS易損斑塊的分子機制。
　　方法
　　在體外實驗中，我們提取C57BL/6小鼠腹腔原代巨噬細胞，給予ox-LDL(100μg/ml)刺激24小時誘導成泡沫細胞，然后分別給予不同濃度Rb1處理24小時。油紅O染色檢測各組細胞脂質(zhì)沉積情況，western blot檢測自噬蛋白LC3Ⅱ和SQS

4、TM1含量，電鏡觀察細胞中脂滴及自噬體膜形成數(shù)量;通過慢病毒轉(zhuǎn)染Atg5siRNA抑制細胞自噬過程，觀察干預(yù)自噬前后，Rb1對巨噬細胞脂質(zhì)代謝的影響;給予AMPK抑制劑Compond C，研究AMPK磷酸化在Rb1介導的自噬中的作用。體內(nèi)實驗中，通過高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠20周構(gòu)建動脈粥樣硬化晚期斑塊模型。然后隨機分為兩個組，分別通過灌胃給予生理鹽水和人參皂苷Rb1(50mg/kg/d)，隔天一次給藥。干預(yù)7周后，病理學方法檢測斑塊

5、脂質(zhì)沉積、巨噬細胞浸潤、平滑肌數(shù)量以及膠原含量，并通過分子學檢測斑塊中自噬蛋白LC3 B和SQSTM1表達及AMPK磷酸化，探究Rb1影響斑塊穩(wěn)定性的可能機制。
　　結(jié)果
　　1.Rb1在20-80μM范圍內(nèi)濃度依賴性地降低了泡沫細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。
　　2.Rb1處理后細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例增加、SQSTM1降低，并且細胞中自噬雙層膜結(jié)構(gòu)增多，提示Rb1促進了細胞的自噬水平。
　　3.經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染Atg5 s

6、iRNA抑制自噬后，Rb1降低泡沫細胞脂質(zhì)沉積的作用明顯減弱。
　　4.Rb1促進了AMPK磷酸化，加入AMPK抑制劑compound C后，Rb1激活自噬的作用減弱。
　　5.與對照組相比，Rb1處理組小鼠斑塊自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例增加、SQSTM1降低，并且AMPK磷酸化增加。
　　6.與對照組相比，Rb1處理組小鼠斑塊脂質(zhì)沉積和巨噬細胞浸潤減少，膠原和平滑肌數(shù)量增多，斑塊穩(wěn)定性增加。
　　結(jié)論