樹突狀細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制和防治中的作用.pdf

1、一實(shí)驗(yàn)研究 第一節(jié)熱休克蛋白60對(duì)小鼠樹突狀細(xì)胞功能影響體外研究 目的：探討動(dòng)脈粥樣硬化中重要炎性物質(zhì)——熱休克蛋白60(HSP60)體外對(duì)小鼠樹突狀細(xì)胞(mDC)功能影響。方法：小鼠骨髓提取DC，體外培養(yǎng)成熟后與兩種濃度mHSP60孵育，動(dòng)態(tài)觀察DC突起改變；流式細(xì)胞儀檢測(cè)孵育前后mDC表面標(biāo)志改變；MLR測(cè)定孵育前后mDC刺激功能變化；ELISA法測(cè)定MLR上清液中細(xì)胞因子濃度。結(jié)果：孵育后，mDC突起增加明顯；CD

2、11c+、CD80及CD86表型顯著增加；淋巴細(xì)胞刺激功能明顯增強(qiáng)；分泌細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ增加(P＜0.01)而IL-4增加不明顯(P＞0.05)，IFN-γ/IL-4比值升高。結(jié)論：mHSP60體外可以促進(jìn)mDC功能，作用呈劑量依賴性。 第二節(jié)過(guò)繼負(fù)載HSP60的致耐受性DC對(duì)小鼠血管內(nèi)皮功能的影響 目的探討負(fù)載熱休克蛋白60(HSP60)的致耐受性樹突狀細(xì)胞(DC)接種對(duì)ApoF-/-小鼠血管內(nèi)皮功能的影

3、響。方法分離ApoF-/-小鼠骨髓DC，分別用HSP60和HSP60加雷帕霉素處理DC，分別獲得負(fù)載HSP60DC(DChsp)和致耐受DC(DChsp+r)。體外檢測(cè)各組DC的功能。分別用DChsp，DChsp+r和鹽水經(jīng)靜脈接種高脂飼養(yǎng)ApoE-null小鼠，共兩次；設(shè)C57BL/6小鼠為未接種正常對(duì)照。末次接種后兩周檢測(cè)T細(xì)胞對(duì)HSP60的反應(yīng)和主動(dòng)脈環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒張功能。結(jié)果體外HSP60可促進(jìn)DC表達(dá)CD86及刺激淋巴細(xì)胞增

4、殖，而致耐受DC其CD86表達(dá)顯著下降。接種小鼠后，DChsp促進(jìn)炎性反應(yīng)，加重內(nèi)皮舒張功能障礙；而DChsp+r明顯抑制炎性反應(yīng)，增強(qiáng)內(nèi)皮舒張功能。結(jié)論熱休克蛋白60致耐受性樹突狀細(xì)胞接種可抑制HSP60特異性免疫應(yīng)答，增強(qiáng)血管內(nèi)皮舒張功能。 第三節(jié)負(fù)載熱休克蛋白60的致耐受性樹突狀細(xì)胞對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響 目的探討負(fù)載熱休克蛋白60(HSP60)的致耐受性樹突狀細(xì)胞(DC)接種對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化

5、斑塊的影響。方法制備ApoE-/-小鼠骨髓DC，分別用HSP60或HSP60加雷帕霉素(rap)處理獲得DCHSP60和rap-DCHSP60，體外檢測(cè)各組DC功能。分別用CFSE染色的DCHSP60和rap-DCHSP60及PBS經(jīng)靜脈接種高脂飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠3次，末次接種后8W觀察各組斑塊面積，CD4+T細(xì)胞和DC在斑塊中浸潤(rùn)情況及脾細(xì)胞對(duì)HSP60的反應(yīng)。結(jié)果體外HSP60負(fù)載DCCD86表達(dá)顯著高于未負(fù)載DC，而致耐受DC

6、CD86表達(dá)顯著低于未負(fù)載DC。接種小鼠后，DCHSP60組斑塊中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯多于PBS組，DCHSP60組斑塊面積大于PBS組；而rap-DCHSP60組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，斑塊面積顯著小于PBS組；HSP60刺激脾細(xì)胞后，DCHSP60組IFN-γ分泌增加，而rap-DCHSP6組IL-10分泌增加，反應(yīng)呈抗原特異性。結(jié)論負(fù)載HSP60的耐受性DC接種可抑制HSP60特異性免疫反應(yīng)，抑制動(dòng)脈粥樣斑塊中的炎癥反應(yīng)和斑塊的進(jìn)展。

7、 二臨床研究第一節(jié)不穩(wěn)定型心絞痛患者樹突狀細(xì)胞的功能 目的研究不穩(wěn)定型心絞痛患者(UAP)樹突狀細(xì)胞(DC)的功能，探討其與UAP時(shí)炎性反應(yīng)的關(guān)系。方法分離34例UAP和21例正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，在含粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)的培養(yǎng)條件下制備DC。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面共刺激分子CD86(B7-2)的表達(dá)；混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測(cè)DC對(duì)同種異體T淋巴細(xì)胞的刺激能

8、力；ELISA法測(cè)定MLR上清液中的細(xì)胞因子；探討CD86表達(dá)與冠心病危險(xiǎn)因素的相關(guān)性。結(jié)果與對(duì)照組比較，UAP者DC表面CD86的表達(dá)明顯增高(P＜0.01)；對(duì)T淋巴細(xì)胞刺激的能力增強(qiáng)；經(jīng)DC刺激的淋巴細(xì)胞分泌致炎細(xì)胞因子(IL-1β，IL-6，TNF-a)增多，抑炎細(xì)胞因子(IL-10)減少,P＜0.001；CD86的表達(dá)與血LDL-C水平正相關(guān)(r0.63,P＜0.01)。結(jié)論UAP者DC的功能亢進(jìn)，由此啟動(dòng)的T淋巴細(xì)胞的增殖和

9、炎性細(xì)胞因子分泌可能是UAP者動(dòng)脈斑塊不穩(wěn)定的原因。 第二節(jié)不穩(wěn)定型心絞痛患者樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的HSP60特異性細(xì)胞毒作用 目的探討不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)患者體內(nèi)是否存在樹突狀細(xì)胞(DC)介導(dǎo)的HSP60特異性的T細(xì)胞毒反應(yīng)。方法分離UAP，穩(wěn)定型心絞痛者和正常人外周血單核細(xì)胞，制備DC。流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSP60負(fù)載及未負(fù)載的DCCD86的表達(dá)及各組T細(xì)胞中CD45RO+細(xì)胞的百分比；MTT法檢測(cè)各組DC刺激自體淋巴細(xì)胞

10、增殖的能力，并檢測(cè)各組DC誘導(dǎo)的細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)對(duì)負(fù)載HSP60的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的殺傷活性；ELISA法測(cè)定HSP60沖擊T細(xì)胞后干擾素γ的分泌。結(jié)果與未負(fù)載HSP60的穩(wěn)定型心絞痛者和正常人的DC比較，UAP者的DC以及負(fù)載HSP60的正常人的DCCD86表達(dá)較高；UAP者的DC及HSP60負(fù)載的DC刺激自體CTL增殖的能力增強(qiáng)；UAP者的DC及HSP60負(fù)載的DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)負(fù)載HSP60的HUVECs有高

11、度的殺傷作用；UAP者體內(nèi)存在HSP60致敏的記憶性T細(xì)胞。結(jié)論UAP者體內(nèi)存在強(qiáng)烈的DC介導(dǎo)的HSP60抗原特異性T細(xì)胞毒反應(yīng)。 第三節(jié)阿托伐他汀對(duì)不穩(wěn)定型心絞痛患者樹突狀細(xì)胞功能的影響 目的研究不穩(wěn)定型心絞痛患者(UAP)樹突狀細(xì)胞(DC)的功能及阿托伐他汀對(duì)其的影響。方法將34例UAP分為常規(guī)治療組(17例)和常規(guī)加阿托伐他汀治療組(17例)，分別于治療前及治療后2周取血分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，在含粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落

12、刺激因子和白介素4的培養(yǎng)條件下制備DC。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面共刺激分子CD86(B7-2)的表達(dá)；混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測(cè)DC對(duì)同種異體T淋巴細(xì)胞的刺激能力；ELISA法測(cè)定MLR上清液中的細(xì)胞因子；探討CD86表達(dá)與冠心病危險(xiǎn)因素及C反應(yīng)蛋白(CRP)的相關(guān)性。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，UAP者DC表面CD86的表達(dá)明顯增高；對(duì)T淋巴細(xì)胞刺激的能力增強(qiáng)；經(jīng)DC刺激的淋巴細(xì)胞分泌致炎細(xì)胞因子(IL-1β，IL-6，TNF-a)增多