RGD修飾的腺病毒介導ING4或-和P53基因表達對人肺腺癌細胞的體內(nèi)外生長抑制作用.pdf

1、目的：
　　在本室已構(gòu)建Ad.RGD空載體和Ad.RGD-ING4重組腺病毒的基礎(chǔ)上，再構(gòu)建Ad.RGD-P53和Ad.RGD-ING4-P53單雙基因重組腺病毒，研究其對人肺腺癌細胞(A549)的體內(nèi)外抑制效應(yīng)及潛在分子機制。
　　方法：
　　PCR克隆獲得P53目的基因，在本室已成功構(gòu)建pAdTrack-CMV-PolyA-promoter、pAdTrack-CMV-ING4-PolyA-promoter轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的

2、基礎(chǔ)上，在多克隆酶切位點NotⅠ和XhoⅠ之間插入P53目的片段，構(gòu)建pAdTrack-CMV-PolyA-promoter-P53和pAdTrack-CMV-ING4-PolyA-promoter-P53重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，再與RGD-4C修飾的腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1.RGD同源重組，經(jīng)QBI-293A細胞包裝、擴增和效價檢測后獲得高滴度重組腺病毒Ad.RGD-P53和Ad.RGD-ING4-P53。本項研究共分5組：PBS組、A

3、d.RGD空載對照組、Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-P53單基因組、Ad.RGD-ING4-P53雙基因組。將上述各組重組腺病毒分別感染A549肺癌細胞后，熒光顯微鏡及流式細胞儀(FCM)檢測各組重組腺病毒對A549肺癌細胞的感染效率。各組重組腺病毒感染A549肺癌細胞后，RT-PCR和Western blot法檢測目的基因ING4或/和P53基因在QBI-293A細胞和A549肺癌細胞中的表達，采用MTT法檢測ING4或/和P

4、53基因表達對A549肺癌細胞增殖的影響，AnexinV-PE/7-AAD雙染后，F(xiàn)CM檢測各組重組腺病毒對A549肺癌細胞的誘導凋亡效應(yīng)，PI單染，F(xiàn)CM檢測各組A549肺癌細胞的周期變化，細胞劃痕實驗和Transwell法檢測各組重組腺病毒對A549肺癌細胞遷移及侵襲能力的影響。Real time-PCR檢測A549肺癌細胞內(nèi)凋亡、周期及遷移和侵襲相關(guān)基因Caspase-3、Bax、Bcl-2、P21、Cyclin E、MMP-2和

5、MMP-9 mRNA的表達水平，Western blot法檢測A549肺癌細胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因Bax、Bad和Bcl-xl的蛋白表達水平。用A549細胞建立裸鼠人肺腺癌移植瘤模型，通過觀察并測量瘤體體積、重量研究ING4或/和P53基因表達對裸鼠人肺腺癌移植瘤的生長抑制作用，免疫組化檢測瘤體細胞的凋亡和周期相關(guān)基因Caspase-3、Bax、Bcl-2、P21及血管形成相關(guān)因子VEGF的蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　PCR和

6、酶切鑒定表明成功構(gòu)建了pAd.RGD-P53和pAd.RGD-ING4-P53同源重組腺病毒質(zhì)粒，包裝擴增后各組重組腺病毒經(jīng)效價檢測可達109-1010 pfu/mL，各組重組腺病毒對A549肺癌細胞的感染效率可達90-95％。RT-PCR和Western blot法證實了腺病毒介導的ING4或/和P53基因能夠在QBI-293A細胞和A549肺癌細胞中成功表達。體外實驗結(jié)果表明腺病毒介導的ING4或/和P53基因表達均能抑制A549肺

7、癌細胞的生長，誘導細胞凋亡，阻滯細胞G1期進程，抑制細胞遷移和侵襲，且Ad.RGD-ING4-P53雙基因組較Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-P53單基因組效果更優(yōu)。體內(nèi)實驗結(jié)果表明ING4或/和P53單雙基因重組腺病毒均能抑制A549裸鼠人肺腺癌移植瘤的生長，且雙基因組較單基因組呈明顯的抑瘤增效效果。分子機制檢測表明ING4或/和P53基因表達能夠上調(diào)細胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bax、Bad，下調(diào)Bcl-2和Bcl-

8、xl的表達，上調(diào)周期相關(guān)基因P21，下調(diào)Cyclin E的表達，下調(diào)腫瘤遷移和侵襲相關(guān)基因MMP-2和MMP-9的表達，下調(diào)腫瘤血管形成相關(guān)因子VEGF的表達，且雙基因組優(yōu)于單基因組。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建RGD-4C修飾的單雙基因重組腺病毒Ad.RGD-P53和Ad.RGD-ING4-P53。
　　2、RGD修飾的ING4或/和P53重組腺病毒均能顯著抑制A549肺癌細胞的生長，誘導細胞凋亡，阻滯細胞G1期進

9、程，并抑制細胞遷移和侵襲，且
　　Ad.RGD-ING4-P53雙基因共表達組較Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-P53單基因組效果更為明顯。
　　3、Ad.RGD-ING4-P53雙基因共表達較Ad.RGD-ING4或Ad.RGD-P53單基因表達在體內(nèi)對A549人肺腺癌裸鼠移植瘤的生長產(chǎn)生更加顯著的抑瘤效應(yīng)。
　　4、腺病毒介導的ING4或/和P53基因表達能通過上調(diào)細胞內(nèi)周期相關(guān)基因P21和下調(diào)Cyclin

10、E的表達阻滯細胞G1期進程，上調(diào)凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bax、Bad和下調(diào)Bcl-2、Bcl-xl的表達誘導細胞凋亡，下調(diào)腫瘤遷移和侵襲相關(guān)基因MMP-2，MMP-9的表達抑制細胞的遷移和侵襲，下調(diào)裸鼠移植瘤內(nèi)腫瘤血管形成因子VEGF的表達抑制腫瘤新血管的生成，且Ad.RGD-ING4-P53雙基因共表達較Ad.RGD-ING4或Ad.RGD-P53單基因表達對上述因子的調(diào)控作用更為明顯，這可能是雙基因共表達發(fā)揮抑瘤增效作用的