RGD修飾的腺病毒介導(dǎo)LIF和IL-24雙基因共表達(dá)對(duì)人白血病細(xì)胞體內(nèi)外的抑癌增效作用.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建RGD修飾的LIF和/或IL-24單、雙基因腺病毒表達(dá)載體，研究其對(duì)人白血病MEG01細(xì)胞及裸鼠移植瘤體內(nèi)外的抑制作用及分子機(jī)制。
　　方法：
　　將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的LIF和/或IL-24重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與RGD修飾的腺病毒骨架質(zhì)粒pAd（RGD）同源重組，經(jīng)QBI-293A細(xì)胞包裝獲得RGD修飾的Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.RGD-LIF-IL24重組腺病毒載體。在293A細(xì)胞中擴(kuò)增

2、并檢測(cè)病毒的效價(jià)。感染白血病K562、MEG01細(xì)胞，熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)RGD修飾后的腺病毒載體對(duì)白血病細(xì)胞的感染效率。體外實(shí)驗(yàn)分為Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24、Ad.RGD-LIF-IL24腺病毒載體組和PBS對(duì)照組、Ad.RGD空病毒載體組。各實(shí)驗(yàn)組感染MEG01細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)目的基因LIF、IL-24的表達(dá)，通過CCK-8法檢測(cè)LIF和/或IL-24基因表達(dá)對(duì)MEG01細(xì)胞增殖的影響

3、，PE-AnexinV/7-AAD雙染后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)攜帶LIF和/或IL-24基因的腺病毒對(duì)MEG01細(xì)胞凋亡的影響。PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期的變化。Transwell法檢測(cè)LIF和/或IL-24基因表達(dá)對(duì)MEG01細(xì)胞侵襲能力的影響。Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Bad、P53的表達(dá)，Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞周期及侵襲相關(guān)基因P21、E2F1、MMP-2/9的表達(dá)。體內(nèi)

4、實(shí)驗(yàn)，建立人白血病MEG01細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，實(shí)驗(yàn)組在瘤體內(nèi)注射腺病毒Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24、Ad.RGD-LIF-IL24進(jìn)行治療，對(duì)照組注射PBS和Ad.RGD空病毒，隔日一次，共注射5次。通過觀察并測(cè)量瘤體體積、重量，研究LIF和/或IL-24基因表達(dá)對(duì)裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用。移植瘤取出后，石蠟包埋切片，免疫組化檢測(cè)相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Caspase3、P53、E2F1的表達(dá)。
　　結(jié)果：<

5、br>　　成功構(gòu)建 RGD修飾的腺病毒載體 Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。經(jīng)RGD修飾后，對(duì)白血病細(xì)胞MEG01的感染效率從30％提升到90%，K562細(xì)胞的感染效率從15%提升到50%左右。Western blot證實(shí)了腺病毒載體攜帶LIF和/或IL-24基因能夠在MEG01細(xì)胞中成功表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與 PBS組和空病毒組相比，Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.

6、RGD-LIF-IL24實(shí)驗(yàn)處理組均能夠明顯抑制 MEG01細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且Ad.RGD-LIF-IL24雙基因共表達(dá)組對(duì)細(xì)胞抑制作用更顯著；周期結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組均能產(chǎn)生G2/M期阻滯作用；侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LIF和/或IL-24單、雙基因表達(dá)均能夠抑制 MEG01細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，且雙基因共表達(dá)的抑制作用更顯著。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，成功建立裸鼠人白血病 MEG01細(xì)胞移植瘤模型，瘤體內(nèi)注射攜帶目的基因LIF和/或IL-24的腺病毒治療

7、后，移植瘤的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，且雙基因共表達(dá)組抑瘤作用更顯著。分子機(jī)制結(jié)果表明：Ad.RGD-LIF-IL24雙基因共表達(dá)能夠明顯上調(diào) Bax、P53、Caspase3、P21和下調(diào) Bcl-xl、Bcl-2、E2F1、MMP-2/9等細(xì)胞凋亡、周期及侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，且其效應(yīng)較Ad.RGD-LIF或Ad.RGD-IL24單基因組更為顯著。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建 RGD修飾的腺病毒載體 Ad.RGD-LIF、Ad

8、.RGD-IL24、Ad.RGD-LIF-IL24。RGD修飾后，能夠顯著提升腺病毒載體對(duì) MEG01和 K562細(xì)胞的感染效率。
　　2、腺病毒載體攜帶LIF和/或IL-24單/雙基因表達(dá)在體外、體內(nèi)均能夠顯著抑制白血病MEG01細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且Ad.RGD-LIF-IL24雙基因共表達(dá)組具有抑癌增效作用。
　　3、腺病毒載體攜帶LIF和/或IL-24單/雙基因在MEG01細(xì)胞中表達(dá)均能明顯上調(diào)Bax、P5