SNORA42在食管癌組織中的表達(dá)和生物學(xué)功能及其作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：SNORA42在食管癌組織、外周血和細(xì)胞系中的表達(dá)
　　目的：研究SNORA42（核仁小RNA42）在食管癌組織、外周血和食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)。并分析SNORA42表達(dá)水平與食管癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.應(yīng)用 RT-qPCR法檢測食管癌組織及癌旁組織中 SNORA42的表達(dá)，并分析SNORA42表達(dá)水平與食管癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。
　　2.應(yīng)用RT-qPCR法檢測正常人和食

2、管癌患者外周血中SNORA42的表達(dá)。
　　3.應(yīng)用RT-PCR和RT-qPCR法檢測食管癌細(xì)胞系中SNORA42的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.RT-qPCR分析結(jié)果顯示，與正常食管上皮組織相比，食管癌組織中SNORA42表達(dá)上調(diào)（P<0.01）。食管癌組織中SNORA42的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度和腫瘤大小無關(guān)（P>0.05），而與腫瘤的TNM分期和淋巴結(jié)浸潤有關(guān)（P<0.05）。
　　2.RT

3、-qPCR法分析結(jié)果顯示，與正常人血清相比，食管癌患者血清中SNORA42表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。
　　3.RT-qPCR和RT-PCR法分析結(jié)果顯示，與人正常食管上皮永生化細(xì)胞相比，KYSE180、Eca109、KYSE30、KYSE510和TE-13細(xì)胞中SNORA42的表達(dá)水平顯著升高，而KYSE170、YES2和TE-1細(xì)胞中SNORA42的表達(dá)水平略有升高。
　　第二部分：SNORA42對食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影

4、響及其作用機(jī)制研究
　　目的：研究SNORA42對食管癌細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力的影響。并探討SNORA42在食管癌細(xì)胞中發(fā)揮作用的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.應(yīng)用 MTS方法、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測敲低或過表達(dá)SNORA42后對食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。
　　2.應(yīng)用Western blotting檢測過表達(dá)SNORA42基因表達(dá)后對周期相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　

5、　3.應(yīng)用ELISA法檢測過表達(dá)或敲低SNORA42基因表達(dá)后對食管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　4.應(yīng)用RNA Pulldown法檢測食管癌細(xì)胞中與SNORA42直接相互作用的蛋白，并用質(zhì)譜分析所得差異條帶。
　　5.應(yīng)用RT-qPCR法檢測食管癌組織及癌旁組織中DHX9 mRNA的表達(dá)。
　　6.應(yīng)用 western blot法驗(yàn)證過表達(dá)或敲低 SNORA42基因表達(dá)后DHX9和SND1蛋白表達(dá)水平的變化

6、。應(yīng)用RT-qPCR法檢測食管癌細(xì)胞中敲低或過表達(dá)SNORA42后DHX9 mRNA表達(dá)水平的變化。
　　7.應(yīng)用western blot法驗(yàn)證在食管癌細(xì)胞中過表達(dá)或敲低SNORA42后DHX9相關(guān)基因表達(dá)水平的變化。
　　8.應(yīng)用MTS方法、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測在食管癌細(xì)胞中敲低DHX9對食管癌細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲能力的影響。
　　9.應(yīng)用 MTS方法、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測 SNO

7、RA42與DHX9兩者聯(lián)合作用對食管癌細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲能力的影響。
　　10.應(yīng)用Western blot方法檢測同時(shí)敲低DHX9和過表達(dá)SNORA42后DHX9相關(guān)基因表達(dá)水平的變化。
　　11.采用全基因組測序方法檢測敲低SNORA42后食管癌細(xì)胞mRNA的變化。
　　結(jié)果：
　　1.MTS法檢測結(jié)果顯示，敲低SNORA42基因表達(dá)能夠抑制食管癌細(xì)胞KYSE30、KYSE170和TE1的增殖能力（P<

8、0.05），而過表達(dá)SNORA42對KYSE30、KYSE170和TE1細(xì)胞的增殖能力具有促進(jìn)作用（P<0.05）。
　　2.Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低SNORA42能夠抑制食管癌細(xì)胞KYSE30、KYSE170和 TE1細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P<0.05），過表達(dá)SNORA42能夠促進(jìn) KYSE30、KYSE170和 TE1細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P<0.05）。
　　3.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，

9、過表達(dá) SNORA42對 KYSE30和KYSE170細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平無影響，但能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞KYSE30和KYSE170細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　4.ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低SNORA42能夠抑制食管癌細(xì)胞KYSE30和KYSE170細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)（P<0.05），過表達(dá)SNORA42能夠促進(jìn)KYSE30和KYSE170細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)（P<0.05）。
　　5.RNA Pulldown實(shí)驗(yàn)聯(lián)合

10、質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，根據(jù)評分篩選出有意義的蛋白：DHX9、SND1，并用western blot實(shí)驗(yàn)方法對RNA Pulldown結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　6.RT-qPCR法分析結(jié)果顯示，與正常食管上皮組織相比，食管癌組織中DHX9 mRNA表達(dá)上調(diào)，且與SNORA42表達(dá)呈正相關(guān)。
　　7.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低 SNORA42基因表達(dá)能夠抑制KYSE30和Eca109細(xì)胞中DHX9相關(guān)蛋白表達(dá)，而過表達(dá)SN

11、ORA42能促進(jìn)DHX9相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　8.MTS法檢測結(jié)果顯示，敲低DHX9基因表達(dá)能夠抑制食管癌細(xì)胞KYSE30和Eca109細(xì)胞的增殖活性（P<0.05）。敲低SNORA42基因表達(dá)同時(shí)敲低 DHX9對食管癌細(xì)胞增殖抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)。同時(shí)過表達(dá)SNORA42和敲低DHX9可部分恢復(fù)過表達(dá)SNORA42對細(xì)胞KYSE30和Eca109增殖的促進(jìn)作用（P<0.05）。
　　9.Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低

12、 DHX9基因表達(dá)能夠抑制KYSE30和Eca109細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P<0.05）。敲低SNORA42同時(shí)敲低DHX9對細(xì)胞KYSE30和Eca109細(xì)胞的遷移和侵襲抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)（P<0.05）。同時(shí)，過表達(dá)SNORA42和敲低DHX9基因表達(dá)后，可部分恢復(fù)過表達(dá)SNORA42對KYSE30和Eca109細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用（P<0.05）。
　　10.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與過表達(dá)SNORA42相

13、比，同時(shí)敲低DHX9和過表達(dá)SNORA42能夠恢復(fù)DHX9相關(guān)功能性蛋白的表達(dá)。
　　第三部分：敲低SNORA42基因表達(dá)對裸鼠體內(nèi)食管癌細(xì)胞成瘤能力作用的研究
　　目的：研究SNORA42對食管癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)增殖能力的影響。并探討SNORA42在食管癌細(xì)胞中發(fā)揮作用的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.對裸鼠移植瘤檢測敲低 SNORA42基因表達(dá)對裸鼠體內(nèi)食管癌移植瘤生長的影響。
　　2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)法

14、檢測裸鼠移植瘤組織中 DHX9、MMP2、MMP9表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，敲低SNORA42基因表達(dá)后裸鼠體內(nèi)移植瘤體積和重量明顯減小。
　　2.免疫組織化學(xué)法分析結(jié)果顯示，與對照組相比，敲低SNORA42基因表達(dá)組裸鼠移植瘤中DHX9、MMP2和MMP9表達(dá)水平均降低。
　　結(jié)論：SNORA42和 DHX9在食管癌患者腫瘤組織中高表達(dá)，且SNORA42與DHX9的表