PARP-1和EMT在卵巢癌中的生物學(xué)功能及意義.pdf

1、研究背景：
　　婦科惡性腫瘤中，卵巢癌的發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，是女性生殖系統(tǒng)第三大惡性腫瘤，但其死亡率卻居第一位。當(dāng)卵巢癌患者以腹水或盆腔包塊就診時(shí)，大多數(shù)已經(jīng)是臨床晚期。卵巢癌減滅術(shù)合并鉑類、紫杉醇為主的聯(lián)合化療是當(dāng)今治療卵巢腫瘤的主要臨床手段。目前，卵巢癌的復(fù)發(fā)及化療耐藥成為困擾臨床的主要障礙。卵巢癌患者對鉑類為主的聯(lián)合化療初次敏感性達(dá)85％，但大多數(shù)患者最終因化療耐藥而導(dǎo)致復(fù)發(fā)。卵巢癌化療耐藥尤其是鉑類耐藥的發(fā)生機(jī)

2、制及逆轉(zhuǎn)途徑已經(jīng)成為目前重要的研究課題。因此，降低患者復(fù)發(fā)率，逆轉(zhuǎn)化療耐藥，卵巢癌化療耐藥相關(guān)機(jī)制的研究成為目前的首要任務(wù)。
　　近年，腫瘤化療耐藥的研究已經(jīng)取得重要進(jìn)展，耐藥機(jī)制主要包括DNA損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)，耐藥蛋白的過度表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)一些蛋白酶的改變引起細(xì)胞解毒功能增強(qiáng)等。目前腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制主要?dú)w因于DNA損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)。聚酰苷二磷酸核糖聚合酶-1（poly-ADP ribose polymerase-1，PARP-

3、1）是存在于絕大多數(shù)真核細(xì)胞的細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，是PARP家族中在體內(nèi)含量最多也最具特異性的成員。PARP-1位于染色體1q41～42區(qū)，包含有23個(gè)外顯子。PARP-1蛋白的分子量為116KDa，包含1014個(gè)氨基酸。通過對細(xì)胞內(nèi)眾多蛋白質(zhì)和酶進(jìn)行翻譯后修飾，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)一系列分子事件。在DNA復(fù)制、DNA的損傷修復(fù)、控制細(xì)胞的增殖分化凋亡、維持基因組的穩(wěn)定等方面，PARP-1發(fā)揮著重要作用。靜息狀態(tài)下，PARP-1在細(xì)

4、胞內(nèi)以非活性狀態(tài)存在。PARP-1對DNA的損傷異常敏感，當(dāng)出現(xiàn)輻射、化療藥物等致使DNA損傷后，損傷的 DNA游離斷端將會激活PARP-1，活化的PARP-1檢測到游離的DNA末端并與之結(jié)合，迅速募集與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白到目標(biāo)位點(diǎn)，進(jìn)一步激活并催化蛋白受體聚ADP核糖基化，ADP核糖基化與組蛋白H1、H2B結(jié)合后，核小體的正常結(jié)構(gòu)受到影響，進(jìn)一步引起染色體結(jié)構(gòu)松弛，損傷部位易于結(jié)合DNA修復(fù)酶，從而參與斷鏈DNA的損傷修復(fù)。然而

5、當(dāng)存在DNA廣泛損傷時(shí)，PARP-1可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究顯示，沉默PARP-1基因或應(yīng)用PARP抑制劑能有效提高卵巢癌耐藥細(xì)胞對順鉑藥物的化療敏感性。
　　在上皮來源的惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transitions，EMT)發(fā)揮了重要作用。EMT是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成為間質(zhì)細(xì)胞并使其發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的過程，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。EMT不僅在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過

6、程中發(fā)揮了重要作用，并且與腫瘤化療耐藥也可能存在一定的相關(guān)性。腫瘤細(xì)胞的EMT主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞的極性喪失及間質(zhì)細(xì)胞具備遷移浸潤能力。它降低了細(xì)胞之間的黏附力、增加了細(xì)胞遷移和浸潤能力，不僅參與胚胎發(fā)育、組織重建、慢性炎癥等過程，也是腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病的重要機(jī)制之一。正常組織的上皮細(xì)胞整齊排列，為具有極性的單細(xì)胞層，細(xì)胞之間黏附緊密而規(guī)律，整齊地附著于基底部的細(xì)胞外基質(zhì)上。間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，沒有極性且細(xì)胞間黏附松散，由于細(xì)胞

7、間黏附性小且無附著部位，因此具有遷移浸潤能力。腫瘤細(xì)胞可通過EMT獲得間質(zhì)細(xì)胞表型，從而實(shí)現(xiàn)對周圍組織的侵襲浸潤。腫瘤細(xì)胞EMT過程中伴有:1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間黏附力，變成不規(guī)則、松散排列的間質(zhì)細(xì)胞;2.細(xì)胞表面標(biāo)記分子表達(dá)改變:如上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白E-cadherin、層連蛋白等表達(dá)下調(diào);間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白如vimentin、纖維蛋白和SMA等表達(dá)上調(diào);同時(shí)活化Snail、Twist、Slug等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。這些改

8、變導(dǎo)致上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間黏附力，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白骨架重組。3.細(xì)胞生物學(xué)行為改變:上皮細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)變?yōu)檫w移浸潤能力較強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞，并獲得侵襲、抗凋亡能力的間質(zhì)表型。有研究發(fā)現(xiàn)EMT減低了非小細(xì)胞肺癌組織對順鉑和紫杉醇的敏感性，由此推斷參與EMT的相關(guān)因子及信號通路的激活或失調(diào)在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和化療耐藥的過程中起協(xié)同作用。
　　絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MARK

9、)通路是EMT過程中的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化及惡性轉(zhuǎn)化等許多生物學(xué)效應(yīng)。MARKs家族包括許多成員，其中在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用的有3種:JNK、p38、ERK。既往研究顯示，PARP-1抑制劑PJ34可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高C13*細(xì)胞對順鉑化療藥物的敏感性。磷酸化的ERK2激活PARP-1的途徑不同于DNA受損引起的PARP-1活化，由此推斷ERK2可調(diào)控PARP-1表達(dá)。由于激活PA

10、RP-1與ERK1/2具有相似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有研究證實(shí)在沒有DNA損傷的情況下，PARP-1可被磷酸化的ERK1/2激活。PARP-1在沒有DNA損傷的情況下被pERK2激活是由于ERK2的磷酸化，而不依賴激酶的活性。pERK2直接作用于某些ERK2的底物使其活化而不依賴激酶的活性。由此我們推斷，MAPK通路因子與PARP-1共同參與EMT，從而影響腫瘤細(xì)胞的化療耐藥。
　　間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白波形蛋白(vimentin)和上皮細(xì)胞

11、標(biāo)記蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)被認(rèn)為是EMT過程中關(guān)鍵的標(biāo)志性分子。Vimentin作為真核生物細(xì)胞中主要的中間纖維，與微管、微絲共同構(gòu)成細(xì)胞支架而維持細(xì)胞的完整性。除了維持細(xì)胞的完整性以外，vimentin的主要功能還包括:①參與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移;②參與細(xì)胞內(nèi)外信號的傳導(dǎo);③參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié);④參與基因組DNA表達(dá)的調(diào)控。其表達(dá)與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，表達(dá)越高，愈后越差。作為EMT、EndoMT的標(biāo)志性分子，viment

12、in在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)都較正常組織高很多。Vimentin在EMT過程中作為重要的上游調(diào)節(jié)因子發(fā)揮關(guān)鍵作用。其表達(dá)與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，表達(dá)越高，愈后越差。作為上皮細(xì)胞連接的黏附劑，E-cadherin表達(dá)減少或沉默表達(dá)可致上皮細(xì)胞離散、失去極性，這提示E-cadherin與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，其可作為腫瘤的抑制因子， E-cadherin的表達(dá)減少或沉默表達(dá)與EMT的進(jìn)展存在密切關(guān)系。E-cadherin的表達(dá)下調(diào)與Viment

13、in的表達(dá)升高相關(guān)，Vimentin的表達(dá)會干擾E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞黏附。在早期卵巢癌中，E-cadherin的表達(dá)增加而不是減少。但是，一旦卵巢癌發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移腹水細(xì)胞顯示，其E-cadherin的表達(dá)比原發(fā)腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)顯著減少。卵巢癌化療耐藥的過程中，PARP-1是否通過與EMT共同作用，影響其化療耐藥，以及對卵巢癌化療耐藥細(xì)胞生長、侵襲的作用，本文做了進(jìn)一步研究。
　　第一部分：PARP-1抑制劑PJ34、 E

14、RK抑制劑U0126對卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV-3生長、侵襲的作用
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　通過卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株SKOV-3中分別加入PARP-1抑制劑PJ34和ERK1/2抑制劑U0126，檢測細(xì)胞的侵襲能力，及E-cadherin和vimentin的表達(dá)，以探討在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中P J34、U0126與EMT的相互作用機(jī)制及對卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV-3生長、侵襲的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　PJ34

15、、U0126干擾卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV-3。實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblotting法檢測處理后細(xì)胞中E-cadherin、vimentin的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。MTT法檢測PJ34、U0126在SKOV-3細(xì)胞增殖中的作用、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測PJ34、U0126在SKOV-3細(xì)胞遷移中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　PJ34、U0126明顯抑制卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV-3的生長增殖，且PJ3

16、4聯(lián)合U0126的作用效果較單用PJ34明顯。PJ34、U0126可提高SKOV-3細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)，vimentin則反之，從而進(jìn)一步抑制卵巢癌耐藥細(xì)胞EMT的進(jìn)展。U0126可增強(qiáng)PJ34對SKOV-3細(xì)胞生長侵襲的抑制作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1.PARP-1和ERK1/2聯(lián)合通過EMT途徑影響卵巢癌耐藥細(xì)胞的生物學(xué)行為。
　　2.PARP-1抑制劑和ERK1/2抑制劑可作為卵巢癌術(shù)后愈后的臨床

17、數(shù)據(jù)分析。
　　3.PARP-1抑制劑和ERK1/2抑制劑的低毒性、高特異性的劑量還需進(jìn)一步研究。
　　4.PARP-1抑制劑聯(lián)合ERK1/2抑制劑可作為卵巢癌靶向治療的新靶點(diǎn)。
　　第二部分：PARP-1、E-cadherin和vimentin在卵巢癌上皮細(xì)胞SKOV-3中的表達(dá)及意義
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　通過檢測PARP-1、E-cadherin和vimentin在卵巢癌上皮細(xì)胞SKOV-3，卵巢癌順鉑

18、耐藥細(xì)胞SKOV-3中的mRNA的水平和蛋白表達(dá)情況，探索卵巢癌順鉑耐藥與PARP-1及EMT的相關(guān)性。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blotting法檢測卵巢癌上皮細(xì)胞，卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中PARP-1、E-cadherin、vimentin的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　PARP-1、vimentin在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV-3陽性表達(dá)率高于卵巢癌上皮細(xì)胞SK

19、OV-3，而E-cadherin則相反，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)。E-cadherin表達(dá)與PARP-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，vimentin表達(dá)與PARP-1表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1.PARP-1，EMT可影響卵巢癌細(xì)胞對鉑類藥物的化療耐藥。
　　2.PARP-1可通過影響EMT中的E-cadherin和vimentin的表達(dá)進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞對順鉑藥物的化療耐藥。