新型表皮生長(zhǎng)因子受體異構(gòu)體EGFRvA在卵巢癌和膠質(zhì)瘤中生物學(xué)功能及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分、EGFRvA通過磷酸化STAT5b促進(jìn)卵巢癌生長(zhǎng)和卡鉑耐藥
　　目的：新型表皮生長(zhǎng)因子受體異構(gòu)體EGFRvA能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)移能力，但是EGFRvA在卵巢癌發(fā)生發(fā)展以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)性等方面的發(fā)揮的作用處于未知狀態(tài)。在本項(xiàng)研究中，我們分析了EGFRvA與人上皮性卵巢癌分期和預(yù)后的相關(guān)性，同時(shí)還研究了過表達(dá)EGFRvA對(duì)人上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)性等方面的作用。
　　方法：首先研究

2、了EGFRvA在人上皮性卵巢癌細(xì)胞系和上皮性卵巢癌患者中的表達(dá)情況。通過慢病毒感染方法，將pWPT-GFP、pWPT-EGFRwt和pWPT-EGFRvA慢病毒表達(dá)載體分別在人上皮卵巢癌細(xì)胞系CAOV3、SKOV3ip1、HEY中過表達(dá)，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。通過CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖和卡鉑耐藥情況。蛋白印跡法檢測(cè)EGFR的磷酸化位點(diǎn)以及經(jīng)典的下游通路，通過 siRNA的方法和聯(lián)合用藥以及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的方法檢測(cè)關(guān)鍵分子的下游。<

3、br>　　結(jié)果：EGFRvA在大多數(shù)人上皮性卵巢癌細(xì)胞系中均有表達(dá)，且與卵巢癌患者的分期呈正相關(guān)。過表達(dá)EGFRvA可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和卡鉑耐藥。EGFRvA主要是通過磷酸化Y845這一位點(diǎn)，進(jìn)而提高下游Stat5b的磷酸化水平，且過表達(dá)EGFRvA可以提高Stat5的下游分子Cyclin A1等基因的表達(dá)水平。聯(lián)合應(yīng)用Stat5的抑制劑或者采用siRNA瞬時(shí)敲降卵巢癌細(xì)胞中的Stat5，可以抑制細(xì)胞增殖和卡鉑耐藥。
　　結(jié)論

4、：EGFRvA可以通過Y845磷酸化位點(diǎn)激活STAT5b,進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)卵巢癌增殖和卡鉑耐藥的功能。
　　第二部分、新型表皮生長(zhǎng)因子受體異構(gòu)體EGFRvA促進(jìn)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞遷移及其機(jī)制探討
　　目的：研究新型表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）異構(gòu)體EGFRvA對(duì)人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞遷移的影響，并深入探討其可能的機(jī)制。
　　方法：首先將pWPT

5、-GFP（空白對(duì)照）、pWPT-EGFRwt（陰性對(duì)照）和pWPT-EGFRvA慢病毒表達(dá)載體分別與慢病毒包裝質(zhì)粒pSPAX2和pMD2.G一起共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得慢病毒顆粒，然后感染膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞，建立U87MG GFP、U87MG EGFRwt和U87MG EGFRvA細(xì)胞系。采用蛋白質(zhì)印跡法和FCM法驗(yàn)證EGFRwt和EGFRvA分別在感染后的細(xì)胞中成功過表達(dá)。采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力的變化。實(shí)

6、時(shí)熒光定量PCR法驗(yàn)證前期基因芯片技術(shù)篩選出的各組細(xì)胞之間表達(dá)水平有明顯變化的52個(gè)基因的mRNA水平，并用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)其中有顯著差異的4個(gè)mRNA的蛋白水平。
　　結(jié)果：穩(wěn)定感染U87MG細(xì)胞后，U87MG EGFRwt和U87MG EGFRvA細(xì)胞中分別過表達(dá)EGFRwt和EGFRvA。相較于EGFRwt過表達(dá)組，過表達(dá)的EGFRvA更能促進(jìn)U87MG細(xì)胞發(fā)生遷移（P＜0.001）。U87MG EGFRvA細(xì)胞中癌基因FB