表皮生長因子受體變異體促進上皮性卵巢癌侵襲及順鉑耐藥的研究.pdf

1、卵巢癌是導致女性癌癥患者死亡的第五大原因，但仍位居婦科腫瘤中患者致死的第一位。在過去的25年中，雖然其生存率有所改善，卵巢癌患者的5年生存率仍低于50％。卵巢癌之所以預后不良，是因為晚期患者發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生化療耐藥。卵巢癌主要分為三種類型，上皮細胞型、基質(zhì)細胞型和生殖細胞型。其中多數(shù)的卵巢癌屬于上皮性卵巢癌。
　　表皮生長因子受體(EGFR)是一種跨膜糖蛋白，屬于受體酪氨酸激酶生長因子受體家族，參與重要的生理過程，如細胞的存活、

2、增殖和運動。在眾多人類腫瘤中，EGFR的過度表達都已被證實與腫瘤晚期和患者預后不佳具有密切相關(guān)性，如乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌和卵巢癌。在人類腫瘤中EGFR的編碼序列經(jīng)常會出現(xiàn)改變。其胞外結(jié)構(gòu)域大部分的缺失的突變與患者預后不佳存在相關(guān)性。通常這些突變體能持續(xù)激活并使腫瘤細胞具有更強的生長能力，以及增加其惡性潛能。
　　最近，de4 EGFR，一種表皮生長因子受體(EGFR)第4外顯子缺失的變異體在膠質(zhì)母細胞瘤和卵巢癌中被發(fā)現(xiàn)。然

3、而，其對卵巢癌的生物學功能目前尚不清楚。在本課題中，我們對de4 EGFR在上皮性卵巢癌中的表達，以及其對上皮性卵巢癌細胞增殖、侵襲力及耐藥性進行了研究。
　　第一部分 de4 EGFR在上皮性卵巢癌中的表達及生物學功能
　　目的:檢測de4 EGFR在上皮性卵巢癌組織中的表達及其對上皮性卵巢癌細胞生物學行為如增殖、侵襲等的影響。
　　方法:通過RT-PCR方法對12例正常卵巢組織及72例上皮性卵巢癌組織中de4EGF

4、R的表達進行檢測;體外實驗中，通過慢病毒感染的方法在三種不同上皮性卵巢癌細胞株SKOV3、CAOV3、ES2中過表達EGFR及de4 EGFR，并通過Western blot方法驗證其過表達的效率。通過CCK-8實驗觀察其對細胞增殖的影響，通過Transwell實驗觀察其對細胞轉(zhuǎn)移與侵襲的影響;體內(nèi)實驗中，通過在裸鼠體內(nèi)成瘤的方法評估de4 EGFR對裸鼠體內(nèi)瘤體大小與腫瘤重量的影響。
　　結(jié)果:研究結(jié)果顯示在上皮性卵巢癌組織有4

5、8.6％(35/72)的de4 EGFR表達。在正常卵巢組織中未檢測到de4 EGFR的表達。在Ⅲ-Ⅳ期的上皮性卵巢癌組織中，de4 EGFR的表達陽性率明顯高于Ⅰ-Ⅱ期的上皮性卵巢癌組織。體外實驗中，通過CCK8實驗的生長曲線發(fā)現(xiàn)，與GFP對照組相比，過表達de4 EGFR的細胞株與過表達EGFR的上皮性卵巢癌細胞株具有相似的促進腫瘤細胞增殖的能力(P＜0.05或P＜0.01)。在體外成瘤實驗中，相比于GFP組，EGFR和de4 EG

6、FR組更能促進腫瘤的生長(P＜0.01和P＜0.05)。但是EGFR和de4 EGFR組之間沒有顯著差異。Transwell實驗發(fā)現(xiàn)過表達de4 EGFR的SKOV3細胞的侵襲能力比對照組要高兩倍(P＜0.001)，在其余的細胞株CAOV3、ES2中也觀察到相同的現(xiàn)象(P＜0.001)。
　　結(jié)論:de4 EGFR在上皮性卵巢癌組織中普遍表達，并與臨床分期正相關(guān)。de4 EGFR可以促進上皮性卵巢癌細胞的增殖并且與EGFR相比其具

7、有更強的促進上皮性卵巢癌細胞侵襲的能力。
　　第二部分 de4 EGFR促進上皮性卵巢癌細胞侵襲的分子機制研究
　　目的:研究de4 EGFR促進上皮性卵巢癌細胞侵襲能力的相關(guān)分子機制。
　　方法:通過慢病毒感染的方法在三種不同上皮性卵巢癌細胞株SKOV3、CAOV3、ES2中過表達de4 EGFR，采用Western blot方法檢測de4 EGFR自身磷酸化及EGF刺激后磷酸化的情況，并研究de4 EGFR對下游信

8、號通路以及與侵襲相關(guān)因子Src，F(xiàn)AK，MMP-9和E-cadherin的影響。通過siRNA干擾的方法下調(diào)過表達de4 EGFR細胞株SKOV3、ES2中FAK的表達，以觀察FAK相關(guān)信號通路的變化及侵襲相關(guān)因子的改變;同時采用Transwell方法，在過表達de4 EGFR細胞株SKOV3中下調(diào)FAK的表達水平后，觀察上皮性卵巢癌細胞侵襲的變化。
　　結(jié)果:Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，de4 EGFR在上皮性卵巢癌細胞中

9、具有更高的自身酸磷酸化水平，且對EGF刺激不敏感。相比于GFP對照組及過表達EGFR的上皮性卵巢癌細胞，過表達de4 EGFR組可以明顯上調(diào)ERK、AKT、Src和FAK的磷酸化水平，并且上調(diào)MMP9而下調(diào)E cadherin的表達。在過表達de4 EGFR細胞株SKOV3中通過siRNA干擾下調(diào)FAK的表達水平后，明顯抑制上皮性卵巢癌細胞的侵襲能力（P＜0.05）。此外，下調(diào)FAK的表達水平后，在過表達de4 EGFR細胞株SKOV3

10、、ES2中可下調(diào)Src，ERK，AKT的磷酸化水平及MMP-9的表達，而上調(diào)E-cadherin的表達。
　　結(jié)論:de4 EGFR可能通過上調(diào)FAK磷酸化水平持續(xù)激活AKT和ERK通路，隨后增加MMP-9的表達，并下調(diào)E-cadherin的表達從而增強上皮性卵巢癌細胞的侵襲能力。
　　第三部分 de4 EGFR促進上皮性卵巢癌細胞對順鉑耐藥的初步研究
　　目的:研究de4 EGFR在上皮性卵巢癌細胞中對于順鉑耐藥的作

11、用。
　　方法:在轉(zhuǎn)染GFP、EGFR、de4 EGFR的兩種不同上皮性卵巢癌細胞株SKOV3和CAOV3中，用不同劑量順鉑作用細胞后，通過CCK-8方法觀察順鉑對腫瘤細胞生長情況的影響，并用流式細胞儀檢測腫瘤細胞的凋亡情況。進一步通過Western blot檢測順鉑處理上述細胞后相關(guān)信號通路如AKT，ERK及凋亡相關(guān)因子如Bcl-2與Bad的變化。
　　結(jié)果:de4 EGFR過表達的上皮性卵巢癌細胞SKOV3對順鉑的抑制率

12、及凋亡率較GFP組及EGFR組明顯降低(P＜0.001及P＜0.01)。在CAOV3細胞中觀察到了相似的結(jié)果。相比于GFP組及EGFR組，轉(zhuǎn)染de4 EGFR的上皮性卵巢癌細胞AKT、ERK分子磷酸化水平升高，而且細胞中凋亡相關(guān)因子如Bcl-2表達上調(diào)、Bad表達下調(diào)。
　　結(jié)論:de4 EGFR可以增強上皮性卵巢癌細胞對順鉑的耐藥，其程度比EGFR更高。de4 EGFR可能通過激活AKT和ERK通路以及上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bad