DSC2在食管癌中的表達(dá)、功能與分子調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、迄今，作為一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制在許多方面依然不甚清楚。Desmocollin 2（DSC2 ）是橋粒膠糖蛋白家族的成員之一，在正常上皮細(xì)胞間的粘附中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道，DSC2 在結(jié)直腸癌等腫瘤組織中表達(dá)下降，推測(cè)會(huì)直接破壞細(xì)胞間的橋粒連接，有損組織結(jié)構(gòu)與功能的完整性。關(guān)于食管癌中DSC2的表達(dá)、功能及其分子調(diào)控機(jī)制，至今未見(jiàn)研究報(bào)道。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在食管癌細(xì)胞，敲降Fascin基因表達(dá)，

2、伴隨著癌細(xì)胞的移動(dòng)侵襲能力減弱與粘附能力增強(qiáng)，DSC2的表達(dá)顯著上調(diào)。提示DSC2 在食管癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演著某種重要角色。因此，有必要把該基因在食管癌中的表達(dá)、功能及其分子調(diào)控機(jī)制等重要科學(xué)問(wèn)題研究清楚。基于此，在本論文中，我們通過(guò)綜合運(yùn)用組織芯片、免疫組化、免疫熒光、Western blotting、RT-PCR、RNA 干擾和真核基因表達(dá)等系列實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，就上述科學(xué)問(wèn)題展開(kāi)深入研究，結(jié)果詳見(jiàn)下述。首先，通過(guò)RT-PCR、免疫

3、組化、免疫印跡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)DSC2 以及橋粒鈣粘素家族其它成員在食管癌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，①與配對(duì)的正常食管上皮組織相比，在食管癌組織中，DSC2 mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)，而DSC3 mRNA 表達(dá)無(wú)顯著差異；對(duì)DSC1，無(wú)論食管癌組織，還是正常食管上皮組織，表達(dá)水平均很低。②與配對(duì)的正常食管上皮組織相比，在食管癌組織中，DSC2 蛋白表達(dá)水平也顯著下調(diào)，并表現(xiàn)出由胞膜異位到胞漿的特點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，DSC2 蛋白表達(dá)，

4、與食管癌組織分化顯著正相關(guān)（P<0.05 ），與臨床分期顯著負(fù)相關(guān)（p<0.05 ），與食管癌患者的生存期顯著正相關(guān)。提示DSC2表達(dá)下調(diào)可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著某種重要作用，檢測(cè)DSC2 表達(dá)可以警示食管癌患者的預(yù)后。
　　 其次，通過(guò)正反兩種實(shí)驗(yàn)策略，探討了DSC2 對(duì)食管癌細(xì)胞的分裂增殖與移動(dòng)能力的影響。①實(shí)時(shí)定量RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同的食管癌細(xì)胞系DSC2的表達(dá)水平存在差異，SHEEC 等

5、食管癌細(xì)胞表達(dá)DSC2的水平較高，EC109和KYSE150等食管癌細(xì)胞表達(dá)DSC2的水平相對(duì)較低，因此，為后續(xù)研究DSC2 功能，提供了良好的對(duì)比細(xì)胞模型。②在EC109和KYSE150 細(xì)胞，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定高表達(dá)DSC2 食管癌細(xì)胞株。分裂增殖與移動(dòng)能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照細(xì)胞相比，DSC2高表達(dá)的KYSE150 細(xì)胞的移動(dòng)能力顯著降低，但分裂增殖能力未見(jiàn)明顯變化；而DSC2高表達(dá)的EC109 細(xì)胞的移動(dòng)能力有

6、所降低，但差異不顯著，分裂增殖能力也無(wú)明顯變化。提示DSC2 在食管癌細(xì)胞移動(dòng)等行為中發(fā)揮作用可能還受其它因素的影響制約。③通過(guò)人工合成的siRNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SHEEC 細(xì)胞。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，伴隨著DSC2 表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞的移動(dòng)能力顯著增強(qiáng)。因此，從多個(gè)不同角度為DSC2 下調(diào)表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞移動(dòng)提供了確切實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 再次，為研究探討DSC2 下調(diào)表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞移動(dòng)的分子機(jī)制，分別以DSC2基因穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和RNA

7、干擾敲降DSC2 表達(dá)的食管癌細(xì)胞為模型，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫印跡等實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)細(xì)胞中β-catenin 蛋白的定位和表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，①與對(duì)照細(xì)胞比較，KYSE150 細(xì)胞過(guò)表達(dá)DSC2后，在細(xì)胞總β-catenin 蛋白無(wú)明顯變化的情況下，細(xì)胞核中的β-catenin 蛋白明顯下調(diào)；②敲降DSC2 表達(dá)能夠顯著促進(jìn)β-catenin蛋白的細(xì)胞核聚集；③TOPflash 熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)分析證實(shí)，KYSE150 細(xì)胞高表達(dá)

8、DSC2后，TOPflash 熒光素酶的活性受到明顯抑制。④至于EC109 細(xì)胞，由于β-catenin/TCF 途徑未被激活，因此，雖然高表達(dá)DSC2，但細(xì)胞的移動(dòng)和黏附能力并未發(fā)生相應(yīng)顯著變化。
　　 上述諸實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致說(shuō)明，食管癌中，DSC2的下調(diào)表達(dá)可能會(huì)引發(fā)β-catenin 蛋白從漿到核的移位，激活β-catenin/TCF 途徑，上調(diào)某些細(xì)胞移動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的移動(dòng)。最后，為了弄清楚DSC2的下調(diào)表達(dá)

9、究竟受哪些因素控制，本論文又從食管癌細(xì)胞中分別克隆了DSC2基因的5 ′端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子序列和3 ′端非翻譯區(qū)（3 ′ UntranslationRegion, 3 ′ UTR ）序列。5 ′端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域富含CG 二聯(lián)核苷酸，提示可能存在CpG 島，即在食管癌組織細(xì)胞中，有在表觀遺傳學(xué)層面調(diào)控DSC2 表達(dá)的可能性。然而，亞硫酸氫鹽修飾基因組測(cè)序結(jié)果表明，無(wú)論是DSC2 低表達(dá)的食管癌細(xì)胞，還是DSC2 高表

10、達(dá)的食管癌細(xì)胞，在DSC2基因啟動(dòng)子區(qū)均未見(jiàn)高甲基化修飾CpG 位點(diǎn)呈現(xiàn)。這說(shuō)明食管癌細(xì)胞中，DSC2的下調(diào)表達(dá)是一種非甲基化調(diào)控機(jī)制。而針對(duì)DSC2基因3 ′UTR的miRNA 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，DSC2基因3 ′UTR 上存在著多個(gè)潛在的miRNA 保守結(jié)合位點(diǎn)。而報(bào)告基因熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，食管癌細(xì)胞中可能的確存在著某種miRNA，結(jié)合DSC2基因3 ′UTR，調(diào)控報(bào)告基因熒光素酶活性，而且該miRNAs 很可能包括miR-25

11、。為確認(rèn)上述結(jié)果，我們選取KYSE150（DSC2 低表達(dá)，miR-25 高表達(dá)）和SHEEC細(xì)胞（DSC2 高表達(dá)，miR-25 低表達(dá)）給予進(jìn)一步驗(yàn)證。報(bào)告基因熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-25 可明顯下調(diào)DSC2 報(bào)告基因熒光素酶活性，轉(zhuǎn)染miR-25 抑制劑可明顯上調(diào)DSC2 報(bào)告基因熒光素酶活性；而當(dāng)把DSC2基因3 ′UTR 上的miR-25 結(jié)合位點(diǎn)突變后，則上述調(diào)控效應(yīng)消失。另外，免疫熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，食管癌

12、細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-25 或miR-25 抑制劑，在DSC2 蛋白表達(dá)本身，亦呈現(xiàn)相應(yīng)變化。這些結(jié)果一致說(shuō)明，miR-25能夠與DSC2基因3 ′UTR 結(jié)合，是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控DSC2 表達(dá)的重要因子。
　　 另外，為了進(jìn)一步確認(rèn)miR-25 可能經(jīng)由調(diào)控DSC2 等靶基因表達(dá)，進(jìn)而影響食管癌細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)行為，本論文又對(duì)miR-25 在食管癌中的表達(dá)及其功能進(jìn)行了深入檢測(cè)分析。定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與配對(duì)的正常食管上皮組織相

13、比，在食管癌組織中miR-25明顯上調(diào)表達(dá)，且與食管癌臨床分期呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.05 ）。而與此同時(shí)還研究發(fā)現(xiàn)，直接轉(zhuǎn)染miR-25，還能夠顯著增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的移動(dòng)能力。
　　 綜上，本論文的系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，1 ）DSC2 在食管癌中顯著下調(diào)表達(dá)，與患者的預(yù)后相關(guān)；2 ）DSC2的下調(diào)表達(dá)可引發(fā)食管癌細(xì)胞β-catenin 蛋白從胞漿到胞核的移位，激活β-catenin/TCF 途徑，促進(jìn)癌細(xì)胞向更惡的方向發(fā)展；3 ）