協同刺激分子B7-H1調控IFIT2的機制及其在食管癌中的應用.pdf

1、近年來，對腫瘤微環(huán)境和腫瘤免疫逃逸機制的深入研究發(fā)現，一組介導免疫調節(jié)的重要分子—免疫卡控點，如B7家族負性協同刺激分子:B7同系物1(B7 homolog1，B7-H1)可異常表達于人類腫瘤組織及腫瘤浸潤的免疫細胞，參與了腫瘤免疫逃逸，并且與患者的臨床病理參數及預后密切相關，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。三角形四肽重復干擾素誘導蛋白2(interferon-induced proteins with tetratricopeptide

2、repeats2，IFIT2)是對腫瘤、病毒和各種藥物最敏感的干擾素刺激基因。IFIT2可促進細胞凋亡。然而，對IFIT2的生物學功能和其在腫瘤發(fā)展中的機制尚不明確。
　　我們使用慢病毒轉染及基因干擾技術構建了食管癌細胞株Eca-109中B7-H1表達下調的模型LV-B7-H1-shRNA，采用基因芯片技術發(fā)現，在LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細胞中IFIT2 mRNA水平顯著上升，但目前B7-H1與IFIT2在腫瘤

3、中作用機制尚不明確。在本課題中，我們采取食管癌作為研究載體，①檢測IFIT2和B7-H1在食管癌組織中的表達，探討IFIT2、B7-H1的關系及IFIT2與食管癌患者臨床指標及預后的關系;②分別檢測B7-H1基因干擾及過表達對食管癌細胞系Eca-109細胞中IFIT2啟動子活性的影響，探討食管癌細胞中B7-H1對IFIT2啟動子的調控機制;③分別檢測B7-H1基因干擾及過表達對食管癌細胞系Eca-109細胞中STAT1、STAT1磷酸化

4、及IFIT2表達水平的影響，抑制JAK及STAT1后檢測Eca-109細胞中IFIT2mRNA水平，探討B(tài)7-H1通過JAK-STAT通路調控IFIT2的機制。通過以上工作來探討B(tài)7-H1在食管癌中調控IFIT2的作用機制。
　　結果：
　　(1)IFIT2主要表達于食管癌細胞及食管上皮細胞的細胞漿和細胞核，在食管癌腫瘤細胞上以低表達為主，在正常的食管上皮細胞上以高表達為主。B7-H1主要表達在食管癌細胞的胞漿及胞膜，在食管

5、癌腫瘤細胞中以高表達為主，而在正常的食管上皮細胞以低表達或不表達為主。男性患者IFIT2染色H-score≥50的比率顯著高于女性患者(x2=9.349，P=0.002);IFIT2染色強度與年齡、T、N、M、TNM分期、腫瘤大小等預后相關因素的關系差異均無統計學意義（P＞0.05）。Log-rank生存分析顯示IFIT2高表達組[57.16(50.83～63.50)]比低表達組[41.58(31.36～51.80)]平均術后生存時間顯

6、著延長15.58個月，差異有統計學意義(x2=6.531，P=0.011)。食管癌組織多因素COX模型分析顯示，IFIT2是食管癌獨立的正性預后因素(HR=0.41，95％CI=0.19～0.88，P=0.023)。以B7-H1的H-score=140為Cut-off值，H-score＞140定為高表達，H-score≤140定為低表達;以IFIT2的H-score=25為Cut-off值，IFIT2的H-score＞25定為高表達，H

7、-score≤25定為低表達。食管癌組織B7-H1與IFIT2表達水平呈顯著負相關(r=-0.203，P=0.044)。
　　(2)我們通過基因干擾技術構建食管癌細胞Eca-109中B7-H1表達下調的模型，流式細胞術及qRT-PCR驗證穩(wěn)定轉染LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細胞株中B7-H1表達水平顯著低于穩(wěn)定轉染LV-Scramble的Eca-109細胞株。雙熒光素酶報告基因檢測系統分析顯示LV-B7-H1-sh

8、RNA的Eca-109細胞(2.66±0.34)中IFIT2啟動子活性顯著高于LV-Scramble的Eca-109細胞(1.00±0.19)(P＜0.001)。我們通過基因過表達穩(wěn)轉細胞系構建技術構建食管癌細胞Eca-109中B7-H1表達上調的模型，流式細胞術及qRT-PCR驗證穩(wěn)定轉染LV-B7-H1的Eca-109細胞株中B7-H1表達水平顯著高于穩(wěn)定轉染LV-NC的Eca-109細胞株。雙熒光素酶報告基因檢測系統分析顯示LV-

9、B7-H1的Eca-109細胞(0.43±0.10)中IFIT2啟動子活性顯著低于LV-NC的Eca-109細胞（1.00±0.18）(P＜0.01)。
　　(3)食管癌細胞LV-B7-H1-shRNA細胞中STAT1水平顯著高于LV-Scramble細胞，差異有統計學意義(P＜0.001)，LV-B7-H1細胞中STAT1水平與LV-NC細胞差異無統計學意義(P＞0.05)。LV-B7-H1-shRNA細胞中phos-STAT1

10、-y701磷酸化水平顯著高于LV-Scramble細胞，差異有統計學意義(P＜0.001)，LV-B7-H1細胞中phos-STAT1-y701磷酸化水平顯著低于LV-NC細胞，差異有統計學意義(P＜0.001)。LV-B7-H1-shRNA細胞中IFIT2水平顯著高于LV-Scramble細胞，差異有統計學意義(P＜0.001)，LV-B7-H1細胞中IFIT2水平顯著低于LV-NC細胞，差異有統計學意義(P＜0.001)。LV-B7

11、-H1-shRNA細胞中IFIT2 mRNA水平顯著高于LV-Scramble細胞，差異有統計學意義(P＜0.05)，選取JAK抑制劑AG490處理LV-Scramble及LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細胞后，LV-B7-H1-shRNA細胞中IFIT2 mRNA升高趨勢被抑制，其他JAK抑制劑AZD1480，CP-690550、CYT387處理細胞后，LV-B7-H1-shRNA細胞中IFIT2mRNA較未處理組差異無統

12、計學意義(P＞0.05)。LV-Scramble轉染LV-Scramble及LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細胞后LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細胞中的IFIT2mRNA表達水平顯著高于LV-Scramble(P＜0.001);LV-STAT1-shRNA轉染LV-Scramble及LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細胞后LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細胞中的IFIT2mRNA表達水平顯

13、著高于LV-Scramble(P＜0.01);LV-STAT1-shRNA轉染的LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細胞中的IFIT2 mRNA表達水平顯著低于LV-Scramble轉染的LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細胞(P＜0.01)。
　　結論:
　　IFIT2在食管癌中低表達，對食管癌的預后判斷具有潛在價值。在食管癌組織中IFIT2與B7-H1表達呈顯著負相關。B7-H1對IFIT2的啟動子活性