B7-H1在食管癌的表達(dá)及其對T細(xì)胞免疫功能的影響.pdf

1、B7-H1(B7 homolog1),也稱PD-L1(programmed death receptor ligand1)或CD274,是近年來發(fā)現(xiàn)的新共刺激分子,它是B7家族的一員。目前研究顯示,B7-H1的受體為PD-1和一個未明確的受體。B7-H1與T細(xì)胞上的受體結(jié)合可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖和分化。
　　B7-H1 mRNA表達(dá)在人體多種組織中,而其蛋白在正常組織中的表達(dá)僅限于巨噬細(xì)胞系統(tǒng)。B7-H1也表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞株和多種

2、腫瘤組織中,某些細(xì)胞因子和炎癥因子可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面B7-H1的表達(dá)。腫瘤細(xì)胞可能通過B7-H1/PD-1共刺激信號途徑逃避宿主對腫瘤的特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　干預(yù)共刺激信號可以成為增強(qiáng)或終止免疫應(yīng)答的一種手段,因而日益受到關(guān)注。目前認(rèn)為,腫瘤細(xì)胞的免疫逃避是食管癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。但是,B7-H1在食管癌的表達(dá)及其對食管癌特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響所知甚少。
　　本研究檢測了B7-H1在食管癌細(xì)胞株和食管癌組織

3、中的表達(dá),分析了其與食管癌患者臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性,并初步探討了B7-H1對食管癌組織浸潤T淋巴細(xì)胞功能的影響。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)食管癌細(xì)胞株EC9706常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。
　　2.B7-H1在食管癌細(xì)胞株EC9706中表達(dá)的檢測應(yīng)用RT-PCR、免疫組化和流式細(xì)胞技術(shù)在mRNA水平和蛋白水平檢測了B7-H1基因在食管癌細(xì)胞株EC9706中的表達(dá)情況。
　　3.

4、B7-H1在食管組織中表達(dá)的檢測應(yīng)用RT-PCR、免疫組化和Western blot技術(shù)在mRNA水平和蛋白水平分別檢測了B7-H1基因在54例食管癌組織和8例癌旁正常食管組織中的表達(dá)情況,并分析了B7-H1的表達(dá)與食管癌患者臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。用Syngene凝膠分析軟件和TotolLab2.0分析軟件分別對54例食管癌組織中B7-H1 mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行了半定量分析,并進(jìn)一步分析了B7-H1 mRNA和B7-H1蛋白在食管

5、癌中表達(dá)的相關(guān)性。
　　4.T淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)采用Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法從食管癌組織中分離T淋巴細(xì)胞,并轉(zhuǎn)移到用可溶性B7-H1-Ig和抗CD3抗體包被的24孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)一段時間后,檢測T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的變化,同時設(shè)立只包被抗CD3抗體的實(shí)驗(yàn)對照。
　　5.ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子T淋巴細(xì)胞體外與抗CD3抗體和B7-H1-Ig共培養(yǎng)48h后,分別收集不同培養(yǎng)體系中的上清,采用ELIS

6、A試劑盒檢測其中IL-10和IFN-γ的含量。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)數(shù)資料計(jì)算陽性率,陽性率的比較采用x~2檢驗(yàn)。計(jì)量資料,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1.B7-H1在食管癌細(xì)胞株EC9706中的表達(dá)RT-PCR、免疫組化和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

7、顯示,食管癌細(xì)胞株EC9706在mRNA和蛋白水平均表達(dá)B7-H1,陽性表達(dá)率為28.88±3.22％,并且B7-H1蛋白定位于細(xì)胞膜和少量胞質(zhì)中。
　　2.B7-H1在食管癌組織中的異常表達(dá)RT-PCR、免疫組化和Western blot檢測結(jié)果顯示,食管癌組織在mRNA和蛋白水平均表達(dá)B7-H1,但食管癌組織中癌細(xì)胞陽性表達(dá)分布不均,團(tuán)片狀分布,有的癌巢表達(dá),有的癌巢不表達(dá),陽性表達(dá)率為48.15％,而所有的癌旁正常食管組織中

8、均檢測不到B7-H1 mRNA和蛋白的表達(dá)。通過對食管癌組織中B7-H1 mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量分析,發(fā)現(xiàn)B7-H1mRNA和蛋白在食管癌組織中的表達(dá)具有高度相關(guān)性(r=0.801,P<0.05)。
　　3.食管癌中B7-H1的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系通過分析B7-H1的表達(dá)與食管癌患者臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)B7-H1在食管癌組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤的部位、食管癌的分化程度及腫瘤的大小無顯著相關(guān)性(P>

9、0.05),與食管癌浸潤深度、周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及p TNM分期有顯著相關(guān)性(P<0.05)。4.ELISA檢測細(xì)胞因子的結(jié)果ELISA檢測結(jié)果顯示,包被B7-H1-Ig和抗CD3抗體的實(shí)驗(yàn)組比起只包被抗CD3抗體的對照組,T淋巴細(xì)胞分泌IL-10升高,而分泌IFN-γ降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.食管癌細(xì)胞可能通過異常高表達(dá)B7-H1而參與免疫逃避,從而促進(jìn)食管癌的發(fā)生。