腫瘤壞死因子α(TNFα)誘導(dǎo)RIP1激酶依賴的Bid剪切介導(dǎo)L929-A細(xì)胞死亡及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、程序性細(xì)胞死亡可以分為I型細(xì)胞凋亡、II型細(xì)胞自噬及III型細(xì)胞程序性壞死。細(xì)胞凋亡在胚胎發(fā)育、免疫系統(tǒng)、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和癌癥等生理和病理狀態(tài)中都發(fā)揮很重要的作用。在經(jīng)典凋亡途徑中，死亡受體通路及線粒體通路激活均可通過活化凋亡的執(zhí)行者Caspases，介導(dǎo)關(guān)鍵蛋白的剪切，引起一串生化反應(yīng)事件使胞內(nèi)組分降解，介導(dǎo)細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡具有典型的特征性表型，包括染色體凝集、凋亡小體、膜泡及DNA片段化等。為了提供能量和營養(yǎng)循環(huán)，細(xì)胞形成了一種進(jìn)化保

2、守策略—自噬，來降解長壽命胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器，當(dāng)受到饑餓、低氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激等刺激時，細(xì)胞就會通過自噬進(jìn)行促存活，使細(xì)胞免于死亡。然而當(dāng)刺激超過某一極限時，會出現(xiàn)大量的自噬小泡，從而引發(fā)細(xì)胞自噬死亡，或稱為Ⅱ型細(xì)胞死亡。
　　程序性壞死雖屬于程序性死亡，但卻與凋亡和自噬均具有特殊的細(xì)胞死亡形態(tài)不同，程序性壞死的細(xì)胞形態(tài)與普通壞死完全相同，在死亡過程中細(xì)胞會發(fā)生質(zhì)膜完整性喪失，細(xì)胞器及細(xì)胞發(fā)生腫脹，最后導(dǎo)致細(xì)胞溶解。
　

3、　TNFα在免疫紊亂和腫瘤發(fā)展的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用，它可以誘導(dǎo)細(xì)胞存活、凋亡和程序性壞死。研究表明TNFα介導(dǎo)不同反應(yīng)的關(guān)鍵取決于形成何種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體。當(dāng)TNFα與TNFR1結(jié)合后首先招募多種蛋白在胞膜區(qū)形成I型復(fù)合體，其中RIP1激酶在cIAPs的作用下發(fā)生K63泛素化修飾，介導(dǎo)NF-κB信號通路活化，促進(jìn)細(xì)胞生存。而當(dāng)RIP1在CYLD、A20或Smac模擬物(SmacM)作用下發(fā)生去泛素化修飾時，細(xì)胞內(nèi)會形成誘導(dǎo)細(xì)胞

4、死亡的II型復(fù)合體。其中由RIP1、FADD、Caspase-8及TRADD組成的復(fù)合體IIa，通過剪切活化Caspase-8，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而在RIP3激酶高表達(dá)的細(xì)胞中，當(dāng)使用zVAD阻斷Caspase的活性時，RIP1與RIP3會結(jié)合，形成complex IIb(又稱為壞死復(fù)合體necrosome)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死。對比細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，通常Caspase抑制劑可以拮抗凋亡但促進(jìn)壞死，而抑制RIP1激酶可以拮抗壞死但對凋亡沒有

5、影響。
　　L929纖維肉瘤細(xì)胞建系于1948年，是一種在國內(nèi)外實驗室被廣泛使用的細(xì)胞系。由于單獨使用TNFα即可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的發(fā)生，因而L929細(xì)胞被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞死亡的實驗研究。但在眾多的實驗報道中TNFα既可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可以誘導(dǎo)細(xì)胞壞死以及細(xì)胞自噬，提示該細(xì)胞系的生物學(xué)特征在不同的實驗體系中可能并不相同。在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)來源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫研究室的L929細(xì)胞（命名為L929-A）雖已在先前的報道

6、中被用于TNFα誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的研究，但其細(xì)胞的死亡調(diào)控卻呈現(xiàn)既不同于經(jīng)典凋亡又不同于程序性壞死的特性，表現(xiàn)為RIP1激酶抑制劑Nec-1及泛Caspases抑制劑z-VAD均可拮抗TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而敲低Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9或采用相關(guān)抑制劑卻不能拮抗細(xì)胞死亡，且細(xì)胞呈現(xiàn)非凋亡的死亡形態(tài)。更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)L929-A細(xì)胞中存在由RIP1、Caspase-8和FADD蛋白組成的Ripoptoso

7、me復(fù)合體，且TNFα刺激后RIP1和Caspase-8之間的相互結(jié)合明顯增強(qiáng)，進(jìn)而介導(dǎo)產(chǎn)生RIP1激酶活性依賴的Bid剪切，與經(jīng)典凋亡通路不同，RIP1激酶依賴的Bid剪切并非通過活化線粒體凋亡信號通路介導(dǎo)細(xì)胞死亡，本研究在此基礎(chǔ)上圍繞Bid剪切介導(dǎo)細(xì)胞死亡的分子機(jī)制展開。
　　首先分別檢測了TNFα對細(xì)胞生存率、細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的生成及鈣離子濃度的影響。結(jié)果顯示TNFα可時間依賴地誘導(dǎo)L929-A細(xì)胞死亡，細(xì)胞死亡出現(xiàn)的

8、時間點是6小時，同時伴隨ROS及鈣離子濃度的升高。采用Nec-1或敲低RIP1蛋白來抑制RIP1激酶活性可以有效拮抗TNFα的細(xì)胞毒性。敲低Bid蛋白同樣可以完全拮抗TNFα的細(xì)胞毒性。
　　隨后通過胰蛋白酶濃度梯度消化法檢測了RIP1、Caspase-8和Bid蛋白的表達(dá)和線粒體定位，結(jié)果顯示RIP1、Caspase-8和Bid蛋白均定位在線粒體外膜上，提示線粒體可能是Bid蛋白的剪切位點。此外研究發(fā)現(xiàn)在TNFα處理后3小時，細(xì)

9、胞尚未出現(xiàn)明顯活性改變之前，伴隨Bid蛋白剪切，線粒體呼吸鏈復(fù)合體III的活性受到抑制，線粒體膜電位下降，ATP水平開始降低。繼而在TNFα處理6小時后出現(xiàn)胞內(nèi)ROS和鈣離子濃度顯著上升，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這些研究結(jié)果證實線粒體呼吸鏈復(fù)合體III的活性受到抑制是介導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，由于敲低RIP1的表達(dá)或采用Nec-1抑制RIP1激酶活性以及敲低Bid蛋白均可以拮抗TNFα誘導(dǎo)的線粒體毒性，保護(hù)細(xì)胞免于死亡，進(jìn)一步證實RIP1激酶依賴的

10、Bid剪切恰恰是啟動線粒體功能抑制和線粒體外膜通透性下降及ATP降低的誘因。
　　本研究的主要發(fā)現(xiàn)是線粒體呼吸鏈復(fù)合體III功能抑制在TNFα誘導(dǎo)L929-A細(xì)胞非經(jīng)典凋亡過程中的重要作用，明確了線粒體呼吸鏈復(fù)合體抑制會直接導(dǎo)致細(xì)胞供能受影響，影響線粒體膜電位穩(wěn)定；同時排除了ROS和胞內(nèi)鈣離子水平的變化是細(xì)胞死亡誘因的可能性。綜上所述，我們的研究進(jìn)一步明確了TNFα誘導(dǎo)RIP1激酶依賴的Bid剪切介導(dǎo)L929-A細(xì)胞非經(jīng)典凋亡的分