神經(jīng)肽Y對巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子α產(chǎn)生的影響及其機(jī)制.pdf

1、神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y, NPY)是一種含有36個氨基酸的多肽,廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng),參與攝食行為、心血管活動、精神活動和痛覺調(diào)制等生理功能的調(diào)節(jié)。除了上述功能以外,NPY還參與了哺乳動物免疫功能的調(diào)節(jié),在一些自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵的作用。NPY通過六種不同的G蛋白偶聯(lián)受體亞型來發(fā)揮作用,包括Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6受體。研究表明,多種免疫細(xì)胞,包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等能夠表達(dá)N

2、PY及其受體,并且在炎性刺激如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)的刺激下,巨噬細(xì)胞能夠分泌NPY。近年來的研究發(fā)現(xiàn),與正常巨噬細(xì)胞相比,Y1受體敲除的巨噬細(xì)胞給予LPS刺激后,分泌腫瘤壞死因子(Tumer necrosis factor α,TNF-α)的水平下降。正常巨噬細(xì)胞應(yīng)用Y1受體拮抗劑后給予LPS刺激后,TNF-α的分泌水平也出現(xiàn)下降。表明NPY可以通過Y1受體調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞TNF-α的產(chǎn)生。但其分子機(jī)制不清

3、。 本課題以小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?研究NPY對巨噬細(xì)胞在LPS刺激下產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子TNF-α的影響,并且初步探討其可能的機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)通過半定量RT-PCR檢測了RAW264.7細(xì)胞株的Y1受體的mRNA水平；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF-α含量；Western blot檢測NPY對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號分子的激活程度。 研究工作取得的主要結(jié)果如下： 1.R

4、AW264.7細(xì)胞的Y1受體的mRNA的表達(dá)：通過RT-PCR檢測了RAW264.7細(xì)胞株的Y1受體的mRNA水平,發(fā)現(xiàn)RAW264.7細(xì)胞株有Y1受體mRNA表達(dá)。 2.NPY對RAW264.7細(xì)胞LPS引起的TNF-α產(chǎn)生的影響：10-8M NPY和100ng/mlLPS共同處理RAW264.7細(xì)胞0.5h,4h后收集上清檢測TNF-α,發(fā)現(xiàn)NPY能夠顯著提高LPS引起的TNF-α產(chǎn)生；預(yù)先加入Y1受體的抑制劑PD16017

5、0能夠阻斷NPY的效應(yīng),說明NPY能夠通過Y1受體提高RAW264.7細(xì)胞在LPS刺激下TNF-α的產(chǎn)生。 3.NPY對RAW264.7細(xì)胞LPS引起的MAPKs激活的影響：10-8M NPY和100ng/mlLPS共同處理RAW264.7細(xì)胞0-0.5h,裂解細(xì)胞,收集蛋白進(jìn)行Western blot分析,發(fā)現(xiàn)NPY能夠增強(qiáng)LPS引起的ERK的激活,而對JNK和p38的激活沒有影響,說明NPY可能通過增強(qiáng)LPS引起的ERK的激

6、活來提高TNF-α的產(chǎn)生。 4.NPY對RAW264.7細(xì)胞PI3K和PKC激活的影響：10-8M NPY處理RAW264.7細(xì)胞0-10min,發(fā)現(xiàn)NPY能夠顯著提高PI3K p85的磷酸化,不能激活PKC,Y1受體拮抗劑可以阻斷此效應(yīng)。推測NPY可能通過激活PI3K通路來增強(qiáng)ERK的激活和TNF-α的產(chǎn)生。 5.NPY激活的PI3K通路對RAW264.7細(xì)胞LPS引起的TNF-α和ERK激活的作用：預(yù)先應(yīng)用1μM的P

7、I3K通路阻滯劑wortmannin孵育細(xì)胞30min后,加入10-8M NPY和100ng/ml LPS共同處理RAW264.7細(xì)胞0-30min,發(fā)現(xiàn)NPY增強(qiáng)LPS引起的ERK的激活的效應(yīng)沒有被阻斷,NPY提高RAW264.7細(xì)胞在LPS刺激下TNF-α的產(chǎn)生的效應(yīng)也不能被wortmannin阻斷。NPY快速激活的PI3K信號通路并不參與其對ERK的激活和TNF-α產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)作用,NPY/Y1可能通過其他信號分子來調(diào)控LPS引

8、起的ERK激活,進(jìn)而調(diào)節(jié)TNF-α的產(chǎn)生。 總之,NPY通過Y1受體對RAW264.7細(xì)胞LPS引起的TNF-α產(chǎn)生存在正向調(diào)節(jié)作用,該作用可能是通過增強(qiáng)LPS引起的ERK激活實(shí)現(xiàn)的。 以往研究發(fā)現(xiàn),在不同的細(xì)胞中NPY能夠通過激活PKC或是PI3K通路來激活ERK信號通路。本課題研究發(fā)現(xiàn),NPY能夠快速激活PI3K通路,但NPY調(diào)節(jié)LPS引起的ERK的激活與NPY引起的PI3K通路的激活并不相關(guān),說明有可能存在別的分子