從DNA損傷角度研究增齡過程中大鼠生精功能衰退機(jī)制及淫羊藿總黃酮的干預(yù)作用.pdf

1、目的：
　　(1)研究增齡過程中大鼠生精功能衰退機(jī)制；
　　(2)研究淫羊藿總黃酮(TFE)對(duì)自然衰老大鼠生精功能衰退的保護(hù)作用，并從調(diào)節(jié)DNA損傷角度探討TFE延緩衰老大鼠生精功能衰退的可能作用機(jī)制。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：分別取不同年齡階段的SD雄性大鼠，即3月齡、9月齡、15月齡和24月齡，每個(gè)年齡階段大鼠各10只，研究不同年齡大鼠生精功能的變化；實(shí)驗(yàn)二：另取10只3月齡SD雄性大鼠作為青年對(duì)照組，30只

2、18月齡大鼠隨機(jī)分為自然衰老組、TFE低劑量組、TFE高劑量組，每組10只，青年對(duì)照組和自然衰老組大鼠灌胃給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％羧甲基纖維素鈉，TFE低、高劑量組分別灌胃給予10 mg/kg、20 mg/kg的TFE，各組灌胃1次/d，每周灌胃6 d后停藥1 d，持續(xù)給藥6個(gè)月后，稱取大鼠體質(zhì)量，腹腔注射水合氯醛麻醉后處死，研究TFE對(duì)衰老大鼠生精功能衰退的干預(yù)作用。
　　主要檢測指標(biāo)如下：(1)快速取出兩側(cè)睪丸，稱取兩側(cè)睪丸重，計(jì)算

3、睪丸指數(shù)；(2) HE染色觀察各組大鼠睪丸組織形態(tài)的變化；(3) ELISA法檢測各組大鼠體內(nèi)睪酮（T）激素水平及各組大鼠睪丸組織中8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的水平；(4)生化法檢測各組大鼠睪丸組織中SOD活性、MDA含量的變化。(5)原位末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測各組大鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡情況；(6) Western Blot檢測各組大鼠睪丸組織中衰老相關(guān)蛋白p21、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)，DNA損傷相關(guān)蛋白γH

4、2AX、Chk1和p-P53的表達(dá)；(7)免疫組化檢測各組大鼠睪丸DNA損傷相關(guān)蛋白γH2AX與ATR的表達(dá)與定位。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一：(1)隨著年齡的增長，大鼠睪丸重和睪丸指數(shù)顯著降低；(2) HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，3、9和15月齡組大鼠睪丸組織生精小管形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，管內(nèi)可見排列整齊的各級(jí)生精細(xì)胞，而24月齡組大鼠睪丸組織生精小管形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，生精細(xì)胞層數(shù)減少，細(xì)胞稀疏，細(xì)胞之間的間隙增大，且有部分脫落現(xiàn)象；(3

5、) ELISA法檢測結(jié)果顯示，隨著年齡增加，大鼠體內(nèi)T的水平顯著降低，大鼠睪丸組織中8-OHdG的水平顯著升高；(4)生化法檢測發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加，大鼠睪丸組織中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高；(5) TUNEL結(jié)果顯示，大鼠睪丸內(nèi)發(fā)生凋亡的生精細(xì)胞數(shù)隨著年齡增長而明顯增加；(6) Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠睪丸組織中衰老相關(guān)蛋白p21、促凋亡蛋白Bax及DNA損傷相關(guān)蛋白γH2AX、Chk1、p-P53的表達(dá)水平均

6、隨著年齡增加而逐漸上調(diào)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平及Bcl-2/Bax的比值隨著年齡增加而逐漸下調(diào)；(7)大鼠睪丸細(xì)胞內(nèi)γH2AX和ATR灶點(diǎn)數(shù)量均隨著年齡增加而明顯升高。
　　實(shí)驗(yàn)二：(1) TFE可明顯升高大鼠睪丸重和睪丸指數(shù)；(2) TFE可明顯改善衰老大鼠睪丸生精小管的形態(tài)結(jié)構(gòu)；(3) TFE可顯著升高大鼠體內(nèi)T的水平，顯著降低睪丸組織中8-OHdG的水平。(4) TFE低、高劑量組大鼠睪丸組織中SOD活性顯著升高，MD

7、A含量顯著降低；(5) TFE低、高劑量組大鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少。(6) TFE可顯著下調(diào)衰老大鼠睪丸組織中p21、Bax、γH2AX、Chk1和p-P53蛋白表達(dá)水平，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平及Bcl-2/Bax的比值。(7) TFE可明顯降低大鼠睪丸細(xì)胞中γH2AX和ATR灶點(diǎn)數(shù)。
　　結(jié)論：
　　(1)增齡過程中雄性大鼠生精功能逐漸減退，其機(jī)制可能與睪丸組織中DNA損傷增多，從而誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡有關(guān)。