自噬途徑在斑馬魚神經系統(tǒng)發(fā)育及神經變性疾病中的作用.pdf

1、自噬機制是近年來發(fā)現(xiàn)的繼凋亡之后細胞程序性死亡的新機制。自噬機制與胚胎發(fā)育、個體生長、代謝和死亡等生命歷程密切相關，自噬的主要功能為降解細胞長壽命蛋白和異常聚集蛋白。神經元內蛋白多為長壽命蛋白質，降解需要自噬途徑參與，但自噬基因與胚胎神經系統(tǒng)發(fā)育的關系仍不清楚。此外，神經變性疾病多是以變性蛋白異常聚集為特征，如帕金森病病理機制是α-synuclein、PINK1等蛋白異常聚集形成Lewy小體。很多綜述文獻報道自噬途徑與帕金森等神經變性疾

2、病有重要聯(lián)系，自噬途徑受阻引起蛋白不能降解而異常聚集，進而誘發(fā)各種神經變性疾病。也有文獻報道促進自噬途徑可能改善神經變性疾病癥狀。但這些報道多數(shù)為綜述性文獻，自噬途徑在神經退行性疾病中的作用機制也仍不清楚。本研究以斑馬魚為實驗動物，在基因/蛋白水平、細胞水平和表型/個體行為三個層次分別研究了自噬基因atg5及相關基因在胚胎神經發(fā)育中的作用和在MPTP誘導的帕金森樣神經退行性病變中的作用，探討了雷帕霉素與MPTP的相互作用及對atg5基因

3、活性的影響。主要研究結果如下：
　　 一、自噬基因atg5在斑馬魚胚神經發(fā)育中具有重要的調控作用
　　 通過自噬基因atg5的時空表達規(guī)律和基因功能分析，發(fā)現(xiàn)atg5基因的表達水平伴隨著胚神經系統(tǒng)的發(fā)生和發(fā)育的變化而變化；通過下調或上調atg5基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)atg5是腦區(qū)和軀干形態(tài)發(fā)生過程的必需因子，同時atg5也可以調控神經元marker基因gli1，huC，nkx2.2，pink1，β-synuclein，xb

4、51和zicⅠ表達。研究進一步發(fā)現(xiàn)atg5是斑馬魚自噬途徑中的一個關鍵基因，可以調控其他自噬基因atg3、beclin1等的轉錄，并影響自噬標識LC3-Ⅱ/LC3I比值的變化。此外，一個重要發(fā)現(xiàn)是ATG5蛋白可能通過一種反饋抑制環(huán)的方式調控自身基因的轉錄。同時發(fā)現(xiàn)另一個自噬基因atg12可能是一個看家基因，且一直處于恒定的高水平表達，提示ATG5-ATG12泛素結合系統(tǒng)的形成可能主要依賴ATG5蛋白水平調節(jié)，而非依賴ATG12蛋白。綜上

5、，atg5基因及自噬途徑參與調控了斑馬魚神經系統(tǒng)的發(fā)生和器官發(fā)育。
　　 二、自噬途徑在MPTP誘導/RAPA抑制的斑馬魚帕金森樣模型中的作用
　　 采用可導致人帕金森疾病的化合物MPTP和自噬誘導劑雷帕霉素(rapamycin，RAPA)分別或共同作用于斑馬魚胚胎/幼體，研究自噬途徑在以帕金森病為代表的神經變性疾病中的作用。
　　 首先根據(jù)MPTP誘導的斑馬魚幼體神經胚發(fā)育畸形、導致中后腦神經元細胞丟失、行為學

6、缺陷、多巴胺神經元標志基因th轉錄水平的下調等指標初步建立了斑馬魚幼魚帕金森模型。通過基因表達檢測發(fā)現(xiàn)MPTP能導致斑馬魚和入神經母細胞瘤細胞atg5表達水平下調，推測可能部分阻斷自噬通路。而自噬促進劑RAPA可以導致斑馬魚幼體處于興奮狀態(tài)，誘導atg5、beclin1等自噬基因表達上調，同時影響神經系統(tǒng)發(fā)育基因huC、xb51、zic1、β-synuclein轉錄水平，提示RAPA可作用于神經系統(tǒng)。進一步研究發(fā)現(xiàn)RAPA對MPTP導致

7、的帕金森模型的神經毒性具有挽救作用，但這種挽救作用是暫時的，兩者主要作用為協(xié)同毒性：表現(xiàn)為高劑量的兩種化合物共同作用于斑馬魚胚胎，畸形更加嚴重、死亡率／畸形率大于同劑量的兩種化合物單獨作用之和。本研究進一步對這種挽救作用和協(xié)同毒性機制進行了初步探討，發(fā)現(xiàn)RAPA和MPTP具有許多共同的靶蛋白，誘導或者抑制蛋白的作用多數(shù)一致，這可能是導致協(xié)同作用的原因；但MPTP可抑制一種34.4kD蛋白的表達，RAPA則與之相反，推測這可能是RAPA能