基于熒光納米材料的蛋白酶新分析方法.pdf

1、蛋白酶在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞生長、形態(tài)維持和神經(jīng)活動等生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。蛋白酶的過度表達(dá)或活性失調(diào)往往與疾病相關(guān)。對蛋白酶結(jié)構(gòu)和功能的研究是生命科學(xué)研究中的熱點(diǎn)。蛋白酶還被廣泛應(yīng)用于疾病的診斷和治療、食品加工和皮革工業(yè)等領(lǐng)域。因此實(shí)現(xiàn)蛋白酶的靈敏檢測具有很重要的實(shí)際意義。目前蛋白酶活性測定主要是采用福林比色法，但這種檢測方法的重復(fù)性不夠好且測定步驟很繁瑣，不能滿足快速測定大量實(shí)際樣品的要求，所以急需開發(fā)簡單、準(zhǔn)確、靈敏的蛋白

2、酶檢測方法。熒光納米材料，如金納米簇、量子點(diǎn)等，由于具有熒光強(qiáng)度高、光穩(wěn)定性強(qiáng)、斯托克斯位移較大和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，在生命科學(xué)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。
　　基于此，本論文利用新型熒光納米材料(金納米簇、量子點(diǎn))獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，開發(fā)了兩種無標(biāo)記的蛋白酶檢測方法和一種半胱氨酸檢測方法，具體工作如下：
　　(1)基于木瓜蛋白酶對牛血清白蛋白(BSA)包覆的金納米簇(BSA-Au NCs)配體蛋白的降解提出了一種新的金納米簇?zé)晒獯?/p>

3、滅機(jī)理，開發(fā)了一種無標(biāo)記木瓜蛋白酶及其抑制劑胱抑素C的檢測方法。木瓜蛋白酶對包覆在BSA-Au NCs表面的BSA的降解可引起B(yǎng)SA-Au NCs的聚集，進(jìn)而使BSA-Au NCs的熒光發(fā)生淬滅。熒光強(qiáng)度的變化對木瓜蛋白酶的濃度有很好的響應(yīng)。該方法對木瓜蛋白酶的檢測有較低的檢測限(0.07μg/mL)。在此基礎(chǔ)上結(jié)合木瓜蛋白酶和其抑制劑胱抑素C的相互作用，實(shí)現(xiàn)對胱抑素C的檢測。相較于其他胱抑素C的免疫檢測方法，本方法是一種選擇性高、穩(wěn)定

4、性好、成本低廉、操作簡單且不需要合成昂貴的抗體和復(fù)雜的修飾過程的非免疫的檢測方法，有著很低的檢測限(4 ng/mL)。此方法成功運(yùn)用于實(shí)際尿樣中胱抑素C的檢測，且在添加回收實(shí)驗(yàn)中獲得了令人滿意的回收率(102.2％-114.9％)。本方法還可以拓展到其它蛋白酶及其抑制劑的檢測。
　　(2)木瓜蛋白酶的活性需要由半胱氨酸激活?；谇懊骈_發(fā)的木瓜蛋白酶熒光傳感器，通過半胱氨酸對木瓜蛋白酶活性的調(diào)節(jié)改變BSA-AuNCs的熒光，實(shí)現(xiàn)了對

5、半胱氨酸的定量檢測。該方法對半胱氨酸的檢測獲得了較低的檢測限(15 nM)和較寬的線性范圍(0.02-10.0μM)，并且具有選擇性好、操作簡單、費(fèi)用低廉等特點(diǎn)。
　　(3)基于無修飾量子點(diǎn)的聚集行為，構(gòu)建了無標(biāo)記的熒光分析方法來檢測凝血酶的活性。帶正電的底物多肽(GGLVPRGSCC)結(jié)合到帶負(fù)電的CdTe量子點(diǎn)表面引起后者發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致CdTe量子點(diǎn)的熒光淬滅。凝血酶的水解作用使得只有不帶電的多肽片段(GSCC)結(jié)合在Cd

6、Te量子點(diǎn)表面，正電荷遠(yuǎn)離CdTe量子點(diǎn)表面，對CdTe量子點(diǎn)的影響減弱，CdTe量子點(diǎn)保持穩(wěn)定、熒光信號保持。通過凝血酶加入前后熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對凝血酶活性的檢測。此方法對凝血酶的檢測有較低的檢測限(1.5μU/mL)，且在血清樣品的添加回收實(shí)驗(yàn)中獲得了較滿意的回收率(94.3-104.7％)。與以往基于量子點(diǎn)的凝血酶活性檢測方法相比，該方法不需要復(fù)雜的量子點(diǎn)修飾過程且響應(yīng)速度快。利用酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光檢測為實(shí)現(xiàn)凝血酶類藥物的高通量篩選