pRB與Smad3的相互作用及結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)信號通路在細(xì)胞生長、分化、遷移和凋亡過程中具有很重要的作用。在此信號通路中，TGF-β先通過其受體磷酸化受體調(diào)節(jié)型Smad(receptorregulatedSmad，R-Smad)，然后磷酸化的R-Smad與共同介導(dǎo)型Smad(commonmediatorSmad，Co-Smad)形成復(fù)合物，復(fù)合物入核直接參與目的基因的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控細(xì)胞的生長和分化。

2、
　　TGF-β信號通路通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子(CKI)的表達(dá)，包括INK4家族的p15Ink4B和Cip/Kip家族的p21Cip1，來抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)的活性，從而使腫瘤抑制因子pRB(retinoblastomaprotein)的磷酸化作用受阻。非磷酸化狀態(tài)的pRB能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F，抑制E2F的轉(zhuǎn)錄活性，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期。本研究在探究pRB的生理功能過程中，驚奇地發(fā)現(xiàn)

3、pRB能夠與Smad3直接相互作用。
　　體內(nèi)外試驗驗證了pRB與Smad3存在相互作用。應(yīng)用免疫共沉淀試驗檢測，結(jié)果顯示pRB與Smad3在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。通過GST沉淀檢測，結(jié)果顯示pRB與Smad3在體外存在相互作用。上述結(jié)果驗證了pRB與Smad3在體內(nèi)外存在相互作用。
　　體內(nèi)外試驗驗證了pRB與Smad3相互作用的結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示pRB與Smad3的相互作用發(fā)生在pRB口袋結(jié)構(gòu)中的B亞結(jié)構(gòu)域及C端結(jié)構(gòu)

4、域與Smad3的MH2結(jié)構(gòu)域。
　　通過點突變試驗驗證了存在于Smad3上介導(dǎo)pRB與Smad3相互作用的至關(guān)重要的氨基酸——位于第282位的丙氨酸。本研究做了單點突變(S236A、L285M、A282T)和雙點突變(I419V/V424M)，通過免疫共沉淀或GST沉淀檢測，結(jié)果顯示在這些突變中，只有A282T能破壞pRB與Smad3的相互作用。
　　通過一段體外合成的具有細(xì)胞滲透性并且含有Ala282的短肽的競爭抑制試驗，

5、進(jìn)一步驗證Ala282在pRB與Smad3相互作用中的重要性。通過免疫共沉淀試驗，結(jié)果顯示，該短肽能夠特異地抑制pRB與Smad3的相互作用。
　　從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度探討pRB與Smad3的相互作用。通過基因克隆;原核表達(dá)pRB的口袋結(jié)構(gòu)域、pRB的C端結(jié)構(gòu)域和Smad3的MH2結(jié)構(gòu)域;運用親和層析、分子排阻凝膠層析純化得到蛋白;體外形成復(fù)合物。但是很遺憾，我們并沒有得到三者的復(fù)合物。
　　本論文的研究結(jié)果首次報道了pRB與