布格呋喃與CYP450-P-糖蛋白的相互作用及生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、藥物代謝是新藥研究過(guò)程中必不可少的重要環(huán)節(jié)，口服藥物的生物利用度和藥物相互作用是評(píng)價(jià)藥物代謝特征的重要指標(biāo)。已知在藥物代謝過(guò)程中，當(dāng)兩種或多種藥物經(jīng)同-代謝酶代謝時(shí)，藥物間則可能由于對(duì)藥酶的競(jìng)爭(zhēng)而發(fā)生相互作用，致使血藥濃度顯著增加，導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。此外，藥物進(jìn)入體內(nèi)在受到藥酶代謝轉(zhuǎn)化的同時(shí)，也可誘導(dǎo)或抑制某些CYP450同工酶的表達(dá)水平和代謝活性，從而調(diào)節(jié)自身和其它化合物的代謝轉(zhuǎn)化，以致改變新藥的安全性和療效。因此，在新藥研發(fā)的臨床

2、前階段明確藥物的主要代謝途徑以及對(duì)藥酶的誘導(dǎo)和抑制，對(duì)于認(rèn)識(shí)個(gè)體間代謝差異和預(yù)測(cè)潛在的藥物-藥物相互作用具有重要意義，此外，還有助于明確某些代謝產(chǎn)物的藥理學(xué)特性和進(jìn)-步開(kāi)發(fā)的價(jià)值。
　　 P-糖蛋白是一類ATP依賴性膜蛋白，在小腸粘膜、血腦屏障、肝細(xì)胞、腎及睪丸等器官均有分布，是上述生理屏障的重要組成部分并發(fā)揮泵出作用，阻礙某些有害物質(zhì)進(jìn)入這些特定部位，同時(shí)也可加快藥物從這些組織部位的消除，從而影響藥物的吸收、分布、代謝和排泄。

3、藥物對(duì)上述器官P-糖蛋白的調(diào)控可引發(fā)非代謝性的藥物相互作用。因此，有必要在新藥研發(fā)階段關(guān)注藥物與P-糖蛋白之間的相互影響。
　　 雖然肝臟是人體最主要的代謝器官，參與大多數(shù)藥物和毒物的生物轉(zhuǎn)化，但除肝臟之外，腸道和腎臟作為吸收和排泄器官也表達(dá)部分CYP同工酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在藥物代謝中的作用同樣不可忽視。
　　 布格呋喃是由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研發(fā)的抗焦慮新藥。前期體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，大鼠口服布格呋喃后具有半衰期短，

4、生物利用度較低，靶器官分布少的特點(diǎn)。布格呋喃可經(jīng)CYP450代謝，同時(shí)也是腸道P-糖蛋白的底物，但參與布格呋喃代謝的同工酶亞型、布格呋喃與CYP450以及P-糖蛋白相互作用的分子機(jī)制和由此產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)還有待進(jìn)一步明確。為此，本研究可分為以下幾方面內(nèi)容：
　　 1.采用大鼠、人肝微粒體和重組人源CYP450同工酶溫孵法，應(yīng)用GC-MS分析技術(shù)，研究參與布格呋喃Ⅰ相代謝的同工酶類型和產(chǎn)物生成的相關(guān)性。2.從酶活性水平、mRNA轉(zhuǎn)

5、錄水平和蛋白表達(dá)水平評(píng)價(jià)多次口服不同劑量布格呋喃對(duì)大鼠肝臟CYP的調(diào)控作用。3.應(yīng)用探針底物法、RT-PCR、western-blotting方法從細(xì)胞、亞細(xì)胞組分、mRNA和蛋白水平考察布格呋喃對(duì)小腸CYP3A、P-糖蛋白和腎CYP2C11、2E1以及P-糖蛋白的影響。4.應(yīng)用整體動(dòng)物、原位腦灌流模型及構(gòu)建P-糖蛋白高表達(dá)MDCK細(xì)胞株研究P-糖蛋白對(duì)布格呋喃腦分布以及多次口服布格呋喃對(duì)腦P-糖蛋白的影響。5-根據(jù)布格呋喃對(duì)藥物代謝酶

6、和外排蛋白的研究結(jié)果，選取可能與布格呋喃合用的四種臨床藥物，考察布格呋喃與其他藥物合用對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)的影響。
　　 研究結(jié)果表明：
　　 一、布格呋喃在大鼠/人肝臟微粒體主要代謝產(chǎn)物鑒定及比較
　　 1.1本研究應(yīng)用的GC-MS分析方法可有效分離布格呋喃在微粒體溫孵體系中的代謝產(chǎn)物并初步鑒定其結(jié)構(gòu)類型。
　　 1.2布格呋喃在大鼠肝微粒體中可代謝為一羥基、一羰基和二羥基代謝產(chǎn)物。布格呋喃在人肝微粒體中的代謝

7、特征與大鼠相似，同樣生成一羥基、一羰基和二羥基類型代謝產(chǎn)物，但代謝速率較大鼠慢，生成的代謝產(chǎn)物種類較大鼠中少。
　　 1.3應(yīng)用CYP同工酶選擇性抑制劑研究結(jié)果顯示，在肝微粒體加入CYP3A4和CYP2E1的抑制劑酮康唑和戒酒硫后，布格呋喃消除速率減慢，各代謝產(chǎn)物生成量明顯減少。體外重組人源CYP3A4和CYP2E1溫孵結(jié)果表明，布格呋喃在重組人源CYP3A4中可迅速被代謝，代謝產(chǎn)物主要為一羰基和二羥基產(chǎn)物。綜合以上結(jié)果，可初步

8、判斷CYP3A4是參與布格呋喃代謝的主要CYP同工酶，一羰基和二羥基化是其催化的主要反應(yīng)。
　　 二、布格呋喃對(duì)大鼠肝臟CYP450s的調(diào)控
　　 2.1布格呋喃（4、16、64mg/kg，1次/日×7）多次給藥可提高大鼠肝臟CYP1A2和2E1活性、基因和蛋白表達(dá)水平也明顯增加，并呈一定劑量-效應(yīng)關(guān)系，但誘導(dǎo)強(qiáng)度弱于經(jīng)典誘導(dǎo)劑β-萘黃銅和乙醇。
　　 2.2多次口服布格呋喃可抑制大鼠肝臟CYP2D活性，對(duì)CYP

9、2C6和CYP2C11活性均有一定程度的誘導(dǎo)作用，但對(duì)CYP3A活性無(wú)明顯影響。
　　 2.3布格呋喃在自身處理的肝微粒體中代謝速率有所提高，提示布格呋喃誘導(dǎo)自身代謝與其對(duì)肝臟藥物代謝酶的誘導(dǎo)有關(guān)。
　　 2.4布格呋喃在濃度為1-10μM時(shí)對(duì)CYP450同工酶存在不同程度抑制作用，但濃度降為0.5μM時(shí)對(duì)CYP450同工酶則無(wú)顯著性影響。
　　 三、布格呋喃對(duì)大鼠腸道和腎臟主要CYP450s和P-糖蛋白的調(diào)控<

10、br>　　 3.1布格呋喃可上調(diào)大鼠小腸CYP3A的催化活性和蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)人源腸道LS-174T細(xì)胞CYP3A4蛋白含量升高，提示布格呋喃可通過(guò)調(diào)控小腸CYP3A蛋白含量提高其的催化活性。同時(shí)，布格呋喃亦可上調(diào)腸道P-糖蛋白含量。應(yīng)用Caco-2細(xì)胞Transwell模型研究發(fā)現(xiàn)，布格呋喃100μM處理72h可明顯降低地高辛在Caco-2單層細(xì)胞的滲透系數(shù)，同時(shí)增加其外排系數(shù)，此改變可被P-糖蛋白抑制劑環(huán)孢菌素所逆轉(zhuǎn)；另一方面，布格

11、呋喃100μM可抑制P-糖蛋白對(duì)地高辛的外排。以上結(jié)果提示，布格呋喃可誘導(dǎo)/抑制腸道P-糖蛋白功能。
　　 3.2布格呋喃多次口服可上調(diào)腎臟CYP2C11、2E1和P-糖蛋白的水平，并且對(duì)腎CYP2E1的上調(diào)倍數(shù)大于肝臟。
　　 四、布格呋喃與大鼠腦P-糖蛋白的相互作用4.1應(yīng)用大鼠原位腦灌流模型研究發(fā)現(xiàn)，布格呋喃在腦中的分布在0-8min內(nèi)呈線性增加；P-糖蛋白抑制劑環(huán)孢菌素可使布格呋喃自血液向腦組織的單向轉(zhuǎn)運(yùn)明顯增加

12、，提示布格呋喃是腦P-糖蛋白的底物，血腦屏障中的P-糖蛋白可對(duì)布格呋喃腦分布產(chǎn)生阻礙作用。
　　 4.2應(yīng)用RT-PCR、westernblot和羅丹明腦-血分布方法檢測(cè)大鼠腦MDR1基因的mRNA和P-糖蛋白表達(dá)及功能發(fā)現(xiàn)，多次口服布格呋喃可上調(diào)P-糖蛋白表達(dá)和功能。
　　 五、布格呋喃對(duì)聯(lián)合用藥的藥代動(dòng)力學(xué)影響研究5.1非那西丁為常用解熱鎮(zhèn)痛藥，體內(nèi)主要經(jīng)CYP1A2代謝生成代謝產(chǎn)物撲熱息痛。當(dāng)布格呋喃與非那西丁聯(lián)合

13、用藥時(shí)，單次給予布格呋喃組非那西丁AUC、峰濃度升高，清除率下降，而其代謝產(chǎn)物撲熱息痛的AUC和達(dá)峰濃度均有所下降；多次給藥組非那西丁的AUC下降，MRT減小，而清除率提高，同時(shí)撲熱息痛的AUC和峰濃度均較對(duì)照組升高。以上結(jié)果與布格呋喃對(duì)肝臟CYP1A2的誘導(dǎo)/抑制相關(guān)。
　　 5.2氯唑沙宗是中樞性肌松劑，在體內(nèi)主要經(jīng)CYP2E1代謝。體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，多次口服布格呋喃組氯唑沙宗的AUC下降，MRT減小，清除率提高，而6

14、-羥基氯唑沙宗的AUC和峰濃度均較對(duì)照組升高，提示布格呋喃多次給藥可在一定程度上加快氯唑沙宗的消除，可能與對(duì)肝臟CYP2E1的誘導(dǎo)密切相關(guān)。但單次給予布格呋喃組氯唑沙宗各藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)無(wú)顯著性變化，說(shuō)明布格呋喃單次口服對(duì)氯唑沙宗體內(nèi)過(guò)程影響不大。
　　 5.3咪達(dá)唑侖屬于苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥，主要由CYP3A同工酶代謝，其清除率主要取決于CYP3A活性。大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，口服布格呋喃后咪達(dá)唑侖達(dá)峰濃度提高，推測(cè)與前

15、述布格呋喃對(duì)CYP3A的體外抑制作用有關(guān)。而多次口服布格呋喃的大鼠表現(xiàn)為咪達(dá)唑侖體內(nèi)AUC、達(dá)峰濃度顯著降低，清除大大加快，但相應(yīng)體內(nèi)代謝產(chǎn)物也減少，提示其體內(nèi)代謝還有其它因素參與。據(jù)報(bào)道，咪達(dá)唑侖是CYP3A和P-糖蛋白共同的底物，布格呋喃多次給藥對(duì)小腸P-糖蛋白也有誘導(dǎo)作用，當(dāng)兩藥合用時(shí)，布格呋喃可通過(guò)誘導(dǎo)P-糖蛋白減少咪達(dá)唑侖的吸收，導(dǎo)致其血藥濃度降低，同時(shí)代謝產(chǎn)物減少。
　　 5.4地高辛為一種中效強(qiáng)心苷，為P-糖蛋白的

16、底物，治療安全范圍較小，毒性反應(yīng)嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及生命。前期研究表明，布格呋喃對(duì)P-糖蛋白有誘導(dǎo)/抑制作用，因此本文對(duì)二者合用時(shí)地高辛的血藥濃度進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，布格呋喃單次口服可明顯升高地高辛血藥濃度（峰濃度升高約25％，AUC升高85％），因此兩藥合用時(shí)，注意避免出現(xiàn)毒副作用。布格呋喃多次給藥可使地高辛達(dá)峰濃度和AUC分別降至對(duì)照組的70％和80％，提示在長(zhǎng)期服用布格呋喃后使用其他P-糖蛋白的底物藥應(yīng)注意藥效學(xué)的監(jiān)控。綜上所述，本