慢病毒轉(zhuǎn)染手冊(cè)

1、慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力?；靖攀雎《据d體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果，在美國(guó)已經(jīng)開(kāi)展了臨床研究

2、，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。慢病毒的應(yīng)用目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)RNAi的研究中。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對(duì)基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的載體然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對(duì)基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞

3、中，甚至可以發(fā)揮長(zhǎng)期阻斷基因表達(dá)的作用。在所構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體中，是由RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)RNA合成的，這是因?yàn)镽NA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會(huì)帶polyA尾。當(dāng)RNA聚合酶Ⅲ遇到連續(xù)4個(gè)或5個(gè)T時(shí)，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會(huì)停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’端形成1~4個(gè)U。U6和H1RNA啟動(dòng)子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動(dòng)子，其特點(diǎn)是啟動(dòng)子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)～21ntRNA和～50ntRNA莖環(huán)結(jié)

4、構(gòu)（stemloop）。在siRNA表達(dá)載體中，構(gòu)成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動(dòng)子分別轉(zhuǎn)錄然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成siRNA；也可由載體直接表達(dá)小發(fā)卡狀RNA(smallhairpinRNAshRNA)載體包含位于RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子和4～5T轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有1~4個(gè)U3’突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過(guò)合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA，然后從

5、中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達(dá)載體。慢病毒載體感染細(xì)胞類型感染分裂和不分裂細(xì)胞感染分裂和不分裂細(xì)胞感染分裂細(xì)胞，但在干細(xì)胞中表達(dá)效率低表達(dá)豐度高水平表達(dá)高水平表達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時(shí)間快（12天）慢（24天）快（12天）滴度滴度高達(dá)1012pfuml最高可達(dá)109－10TUml最高可達(dá)109－10TUml克隆容量可插入高達(dá)8kb的外源片段，滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低可插入不超過(guò)8kb的外源片段，滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降

6、低可插入不超過(guò)6kb的外源片段免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性動(dòng)物模型不能得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，效率達(dá)50以上可以，但很難啟動(dòng)子可以更換特異性啟動(dòng)子可以更換特異性啟動(dòng)子不需要啟動(dòng)子能否用于MIRCNA可以可以不可以能否用于四環(huán)素誘導(dǎo)不可以TETONTETOFF不可以系統(tǒng)的目的與意義●對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，這就為