dgge微生物工程

1、綜述題目：綜述題目：DGGETGGEDGGETGGE技術(shù)的原理及應(yīng)用技術(shù)的原理及應(yīng)用1.1變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳基本原理原理1.11發(fā)展歷史DGGE技術(shù)是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于檢測(cè)DNA突變的一種電泳技術(shù)。它的分辨精度比瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳更高可以檢測(cè)到一個(gè)核苷酸水平的差異。Muyzer[1]等人在1993年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究。后來(lái)又發(fā)展出其衍生技術(shù)，溫度梯度凝膠電泳

2、（temperaturegradientgelelectrophesis，TGGE）。此后十年間，該技術(shù)被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一。1.12基本原理雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長(zhǎng)度的DNA片段能夠被區(qū)分開(kāi)，但同樣長(zhǎng)度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區(qū)分。DGGETGGE技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)

3、上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長(zhǎng)度但序列不同的DNA片段區(qū)分開(kāi)來(lái)。一個(gè)特定的DNA片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(meltingdomainMD)和解鏈行為(meltingbehavi)。一個(gè)幾百個(gè)堿基對(duì)的DNA片段一般有幾個(gè)解鏈區(qū)域，每個(gè)解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對(duì)組成。當(dāng)溫度逐漸升高（或是變性劑濃度逐漸增加）達(dá)到其最低的解鏈區(qū)域溫度時(shí)，該區(qū)域這一段連續(xù)的堿基對(duì)發(fā)生解鏈。當(dāng)溫度再高依

4、次達(dá)到各其他解鏈區(qū)域溫度時(shí)，這些區(qū)域也依次發(fā)生解鏈。直到溫度達(dá)到最高的解鏈區(qū)域溫度后，最高的解鏈區(qū)域也發(fā)生解鏈，從而雙鏈DNA完全解鏈。不同的雙鏈DNA片段因?yàn)槠湫蛄薪M成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈溫度也是不一樣的。當(dāng)它們進(jìn)行DGGETGGE時(shí)，一開(kāi)始溫度（或變性劑濃度）比較小，不能使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時(shí)DNA片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。然而一旦DNA片段遷移到一特定位置，其溫度（或變性劑

5、濃度）剛好能使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈時(shí)，雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域立即發(fā)生解鏈。部分解鏈的DNA片段在膠中的遷移速率會(huì)急劇降低。因此，同樣長(zhǎng)度但序列不同的DNA片段會(huì)在膠中不同位置處達(dá)到各自最低解鏈區(qū)域的解鏈溫度，因此它們會(huì)在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導(dǎo)致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開(kāi)來(lái)。1.13操作過(guò)程該技術(shù)主要包括以下步驟:①樣品的采集②樣品總DNA提取及純化③樣品16SrDNA片段的PCR擴(kuò)增④預(yù)實(shí)驗(yàn)(主要是對(duì)