基因表達(dá)載體構(gòu)建

1、一、簡述原核生物和真核生物基因表達(dá)調(diào)控的異同點(diǎn)，并說明基因表達(dá)調(diào)控與基因工程表達(dá)載體構(gòu)建的關(guān)系。1原核生物和真核生物基因表達(dá)調(diào)控的共同點(diǎn)：（1）結(jié)構(gòu)基因均有調(diào)控序列；（2）表達(dá)過程都具有復(fù)雜性，表現(xiàn)為多環(huán)節(jié)。2不同點(diǎn)：原核生物：（1）RNA聚合酶只有一種，其σ因子決定RNA聚合酶識(shí)別特異性；（2）操縱子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白與阻遏機(jī)制的普遍性（負(fù)性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)）；（4）轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)進(jìn)行；（5）轉(zhuǎn)錄后修飾、加工過程簡單；（6）轉(zhuǎn)錄起

2、始是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。真核基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)：（1）RNA聚合酶有三種，分別負(fù)責(zé)三種RNA轉(zhuǎn)錄，每種RNA聚合酶由約10個(gè)亞基組成；（2）活性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；（3）正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)；（4）轉(zhuǎn)錄和翻譯分隔進(jìn)行；（5）轉(zhuǎn)錄后修飾、加工過程較復(fù)雜；（6）轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。3.由于基因的表達(dá)調(diào)控受到多種因子的影響，而構(gòu)建基因工程表達(dá)載體時(shí)多是將真和生物的目的基因轉(zhuǎn)入到原核生物載體上表達(dá)，所以應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）外源基因插

3、入序列必須保持正確的方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏、或錯(cuò)位及錯(cuò)碼。否則會(huì)導(dǎo)致編碼錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)分子，特別是目的基因序列內(nèi)部應(yīng)不含兩端酶切位點(diǎn)的識(shí)別序列。（2）插入的外源基因必須放在原核的啟動(dòng)子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能夠識(shí)別插入的基因。（3）外源基因必須能在大腸桿菌中進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄（如無內(nèi)含子），轉(zhuǎn)錄后的mRNA在菌體必須相當(dāng)穩(wěn)定，并且能有效地進(jìn)行翻譯，轉(zhuǎn)譯的蛋白分子在菌體內(nèi)不致于受菌體蛋白酶的降解。二、目的基因功能和

4、表達(dá)分析的意義是什么？目的基因功能與表達(dá)分析的主要環(huán)節(jié)有哪些？各有什么目的？這些環(huán)節(jié)與基因工程的主要環(huán)節(jié)有什么異同？1意義：克隆的目的基因只有通過表達(dá)才能探索和研究基因的功能及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，明了其利用價(jià)值和途徑。2主要環(huán)節(jié)：（1）目的基因的獲得和加工：將得到的目的基因通過加工以期能連接到表達(dá)載體上并穩(wěn)定表達(dá)；（2）載體的選擇與加工：根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)條件選擇不同的載體，并誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異型啟動(dòng)子三類，它們可使外源基因在

5、植物細(xì)胞中表達(dá)；當(dāng)啟動(dòng)子與顯性選擇標(biāo)記基因及報(bào)告基因連接，構(gòu)成嵌合基因時(shí)，這些標(biāo)記基因同樣能表達(dá)，從而可提供用于篩選和鑒定的表型。（3）植物表達(dá)載體的構(gòu)建中間表達(dá)載體不能將外源基因轉(zhuǎn)化進(jìn)植物細(xì)胞，因此，必須將中間表達(dá)載體引入到上述已改造的受體Ti質(zhì)粒中，并構(gòu)建成能侵染植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化載體(它是由兩種以上質(zhì)粒構(gòu)成的復(fù)合型載體，故稱之為載體系統(tǒng))，才能在植物基因轉(zhuǎn)化中應(yīng)用。為利用根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，發(fā)展了一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。一元

6、載體系統(tǒng)是指首先將目的基因插入到中間表達(dá)載體上，篩選出含有目的基因的重組分子，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌中，重組質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti質(zhì)粒上，用于侵染植物細(xì)胞。TDNA重組分子就可整合到植物細(xì)胞染色體DNA上。最后利用植物選擇標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。雙元載體系統(tǒng)是指由兩個(gè)分別含TDNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)粒構(gòu)成的系統(tǒng)。其中之一是含有TDNA轉(zhuǎn)移所必需的Vir區(qū)段質(zhì)粒，它缺失或部分缺失TDN

7、A序列。它的主要作用是表達(dá)毒蛋白，激活TDNA的轉(zhuǎn)移，故稱為輔助Ti質(zhì)粒(helperTiplas)；另一個(gè)則是含有TDNA的質(zhì)粒，一般作為目的基因的載體，由于其分子量較小，故稱為微型質(zhì)粒(miniTiplas)。它是一種寄主范圍廣泛的DNA轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒。它既含有大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)，又含有根癌農(nóng)桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)，實(shí)際上是一種大腸桿菌農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒。這兩種質(zhì)粒在單獨(dú)存在的情況下，均不能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生冠癭瘤。若根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在這兩種

8、質(zhì)粒時(shí)，便可獲得正常誘導(dǎo)腫瘤的能力。因此，含有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞浸染植物時(shí)，就可以將含有目的基因的TDNA整合進(jìn)植物基因組中。目前以TDNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法大多采用Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的雙元載體系統(tǒng)。首先將目的基因插入到微型質(zhì)粒，含有目的基因的重組微型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，再導(dǎo)入攜帶輔助Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌中，經(jīng)篩選后直接感染植物細(xì)胞。根癌農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，植物的創(chuàng)傷信號(hào)啟動(dòng)Ti質(zhì)粒上的vir基因，隨后將微型質(zhì)粒上的TDNA切割下