雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)S07基因免疫調(diào)節(jié)型核酸疫苗的研究.pdf

1、　　本研究將柔嫩艾美耳球蟲(chóng)SO7基因單獨(dú)或與雞白細(xì)胞介素2基因融合克隆入pVAX1.0和pcDNA4.0(c)制備免疫調(diào)節(jié)型核酸疫苗，并用構(gòu)建的核酸疫苗免疫動(dòng)物，評(píng)價(jià)對(duì)E.tenella攻蟲(chóng)的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)具體分為以下幾個(gè)部分： E.tenellaSO7基因的克隆、鑒定及序列分析　　根據(jù)已發(fā)表的SO7基因序列，利用電腦軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，從E.tenella部分孢子化的卵囊中提取總RNA，然后應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出E.te

2、nellaSO7基因并與pMD18-T載體連接，對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定、PCR鑒定和測(cè)序分析。 E.tenellaSO7基因的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物純化　　將SO7基因克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+)中并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliBL21，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。SDS-PAGE電泳顯示，表達(dá)的融合蛋白的分子量為40KD左右，且在誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)后表達(dá)量最多，大約占菌體總蛋白的22.4﹪。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解破碎，TritonX-1

3、00洗滌，得到的包涵體被純化，SDS-PAGE電泳顯示，PET32a(+)-SO7表達(dá)的重組蛋白大部分存在于包涵體中，上清中含量很少。 免疫調(diào)節(jié)型核酸疫苗的構(gòu)建　　利用重組DNA技術(shù)，構(gòu)建pVAX1.0-SO7、pVAX1.0-SO7-IL2、pcDNA4.0(c)-SO7疫苗，酶切鑒定正確后，將重組質(zhì)粒按100μg/羽雞分別接種14日齡雛雞，7天后取注射部位肌肉、非注射部位肌肉、血液，用RT-PCR和Western-blot

4、ting檢測(cè)保護(hù)性抗原的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)情況。 E.tenella免疫調(diào)節(jié)型核酸疫苗的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)　　用提純的SO7、雞IL2重組蛋白和pVAX1.0-SO7、pVAX1.0-SO7-IL2、pcDNA4.0(c)-SO7重組核酸疫苗，經(jīng)肌肉于14日齡、21日齡兩次注射雛雞，28日齡經(jīng)口接種新鮮的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊。35日齡撲殺，分別作盲腸病變計(jì)分、克盲腸糞便卵囊數(shù)(OPG)、增重、綜合抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)幾個(gè)指標(biāo)測(cè)定，確定其保護(hù)