rcs大鼠眼球冰凍切片前固定的方法

1、1RCS大鼠眼球冰凍切片前固定的方法大鼠眼球冰凍切片前固定的方法曾玉曉，陳麗峰，劉康，徐海偉（400038重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)西南眼科醫(yī)院）[摘要摘要]目的目的尋找一種適合于遺傳性視網(wǎng)膜色素變性的動(dòng)物模型RCS大鼠眼球冰凍切片前的固定方法。方法RCS大鼠5只，麻醉灌注后，5只眼行4%多聚甲醛固定1h，30%蔗糖脫水過夜；5只眼用福爾馬林、酒精、冰醋酸混合固定液（Davidson’sFluid）固定12h后，以5%、10%、20%、30%蔗

2、糖進(jìn)行梯度脫水各4h；再行眼球OCT包埋冰凍切片。結(jié)果結(jié)果Davidson’s固定后的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清晰，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞排列緊密，無明顯裂隙存在，且發(fā)生人為視網(wǎng)膜脫離概率低，無自發(fā)熒光干擾；相反，采用4％多聚甲醛固定的視網(wǎng)膜組織各層細(xì)胞排列較疏松，有一定的裂隙或空泡存在。結(jié)論結(jié)論Davidson’s固定液適用于RCS大鼠視網(wǎng)膜組織的固定，效果優(yōu)于單純的4％多聚甲醛固定液。[關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞]眼球；冰凍切片；固定；RCS大鼠[中圖法分

3、類號(hào)][文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A皇家外科學(xué)院大鼠(royalcollegeofsurgeonsratRCS)為遺傳性視網(wǎng)膜色素變性的經(jīng)典動(dòng)物模型，是由于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞Merker基因缺失，喪失對(duì)光感受器細(xì)胞外節(jié)的吞噬能力，繼發(fā)性導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性的一種常染色體隱性遺傳病[1]。由于RCS大鼠視網(wǎng)膜變性后組織變薄，常規(guī)方法固定后人為性視網(wǎng)膜脫離概率高、組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)欠佳，且極易發(fā)生脫片，這使得對(duì)其行冰凍切片具有相當(dāng)難度。采用常規(guī)的冰凍切片前的固定脫

4、水方法，并不能滿足此變性大鼠視網(wǎng)膜切片的實(shí)驗(yàn)要求，而進(jìn)行視網(wǎng)膜下腔細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)后，需要維持很好的視網(wǎng)膜組織形態(tài)，并實(shí)時(shí)觀察熒光標(biāo)記的細(xì)胞，又必須進(jìn)行冰凍切片，因此本實(shí)驗(yàn)旨在探索一種更加適合于變性大鼠視網(wǎng)膜冰凍切片的前固定方法。1材料與方法材料與方法1.1主要儀器和試劑冰凍切片機(jī)(LeicaCM1900型)，光學(xué)顯微鏡(OlympusBX51)。OCT包埋劑購自Sakura公司，Davidsons固定液由體積分?jǐn)?shù)為10%的中性緩沖甲醛、9

5、5%乙醇、冰醋酸和蒸餾水依據(jù)體積比2∶3∶1∶3配制而成[2]。1.2方法1.2.1取材與固定采用體質(zhì)量100g左右的SPF級(jí)RCSp大鼠5只(黑頂，色素眼，視網(wǎng)膜變性)，由美國(guó)加利福利亞大學(xué)Beckman視覺中心贈(zèng)送，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)繁殖。麻醉后經(jīng)心臟行生理鹽水100ml灌注再用4%多聚甲醛灌注50ml，取出眼球，用1ml空針針頭在角鞏膜緣扎一小洞，其中5只眼為實(shí)驗(yàn)組用福爾馬林、酒精、冰醋酸混合固定液

6、（Davidson’sFluid）固定12h，再以5%、10%、20%、30%蔗糖行進(jìn)梯度脫水各4h。5只眼為對(duì)照組行常規(guī)大鼠眼球固定方法，即4%多聚甲醛固定1h，30%蔗糖脫水過夜；之后均行筋膜、角膜前節(jié)、晶狀體、玻璃體和固定液等的去除。1.2.2包埋將OCT包埋劑滴入填滿眼杯，避免氣泡，再放入盛有OCT的塑料小容器里，小心攪勻后4℃放置半小時(shí)，使包埋劑充分滲透組織，然后放在液氮罐口迅速冷凍[3]，置到冰凍切片機(jī)里面，半小時(shí)后切片。1

7、.2.3切片冷凍箱溫度穩(wěn)定在－20～－22℃，切片厚度為10～12μm。根據(jù)標(biāo)記的位置選擇放在冷凍頭上的方向后開始修切組織，到達(dá)想要的部位且觀察視網(wǎng)膜未脫離牽拉，就可以貼片。2結(jié)果結(jié)果Davidson’s實(shí)驗(yàn)組在光學(xué)顯微鏡下觀察到視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清晰，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞排列緊密，無明顯裂隙或皺褶、空泡存在，且發(fā)生人為視網(wǎng)膜脫離概率低，見圖1A；免疫熒光染色后仍能保持良好形態(tài)，并無自發(fā)熒光干擾。盡管對(duì)照組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)也較清晰，但相對(duì)于

8、實(shí)驗(yàn)組而言，各層細(xì)胞排列較疏松，有一定的裂隙或空泡存在，見圖1B。A：實(shí)驗(yàn)組；B：對(duì)照組圖2光學(xué)顯微鏡觀察RCSp大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)（200）3討論討論視網(wǎng)膜色素變性疾病的RCS大鼠是研究者對(duì)此類疾病發(fā)生發(fā)展認(rèn)識(shí)或治療性研究的經(jīng)典動(dòng)物模型。在以往的光鏡及電鏡研究中發(fā)現(xiàn)，RCS大鼠出生后外核層厚度逐漸變薄及內(nèi)核層厚度逐漸變厚，視桿外節(jié)的結(jié)構(gòu)紊亂，隨后出現(xiàn)內(nèi)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂。細(xì)胞體皺縮、消失。在病變發(fā)展到中晚期時(shí)，由于感光細(xì)2胞變性死亡出現(xiàn)了視網(wǎng)

9、膜內(nèi)層形態(tài)重構(gòu)。因此，獲取高質(zhì)量的組織切片對(duì)于視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究至關(guān)重要。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：采取常規(guī)多聚甲醛固定大鼠眼球，雖然能保證視網(wǎng)膜各層次的良好形態(tài)，但只適用于普通正常大鼠；對(duì)于視網(wǎng)膜本身變性的RCS大鼠，要在病變狀態(tài)下仍然保持其細(xì)胞結(jié)構(gòu)，單純采用多聚甲醛來固定有所欠佳。所以擬尋求一種混合固定液來滿足實(shí)驗(yàn)的需求。Moe等[4]報(bào)道一種Davidsons混合固定液，對(duì)細(xì)胞核細(xì)節(jié)保存更完整；后來Latendresse等[5]闡述D

10、avidsons液對(duì)小標(biāo)本來講是一種快速固定液，并發(fā)現(xiàn)用于石蠟切片前的眼球固定可以得到很好的效果。由此，我們嘗試采用Davidsons液固定RCS大鼠眼球并進(jìn)行冰凍切片，同時(shí)與多聚甲醛固定組相比，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)Davidsons液的固定，制片效果好，視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清晰，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞排列緊密無明顯裂隙或皺褶、空泡存在，細(xì)胞細(xì)節(jié)更加完整。免疫熒光染色后，背景干凈清晰。更為重要的是，明顯地降低了視網(wǎng)膜脫離的概率。我們認(rèn)為利用Davids

11、ons固定液在RCS大鼠視網(wǎng)膜能夠取得制片效果，是因?yàn)镈avidsons液是福爾馬林、酒精、冰醋酸混合，甲醛是能快速滲透組織，但易導(dǎo)致細(xì)胞核、細(xì)胞漿嚴(yán)重凝集，細(xì)胞細(xì)節(jié)被破壞，而冰醋酸有抗皺縮的作用，乙醇安全性好，處理簡(jiǎn)便，它是通過破壞氫鍵使蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)得以破壞，不會(huì)導(dǎo)致組織的快速皺縮。參考文獻(xiàn)：參考文獻(xiàn)：[1]NagarSKrishnamothyVCherukuriPetal.Earlyremodelinginaninduciblea

12、nimalmodelofretinaldegeneration[J].Neuroscience2009160(2):517529.[2]盛嬅，王輝，陸姮磊，等Davidson’s固定液用于睪丸和眼球固定的優(yōu)勢(shì)［J］毒理學(xué)雜志，200721(4)：291[3]彭周貴一種快速冷凍切片方法制作小鼠眼球切片［J］重慶醫(yī)學(xué)，201039（21）：2969，2987[4]MoeKLGrahamMABarrML.Thedetectionofchrom

13、osomalsexinhermaphroditesfromaskinbiopsy[J].SurgGynecolObstet195396(6):641648.[5]LatendresseJRWarbrittionARJonassenHetal.FixationoftesteseyesusingamodifiedDavidsonsfluid:comparisonwithBouinsfluidconventionalDavidsonsflui